狼毒及其制劑的化學(xué)成分分析及代謝產(chǎn)物和蛋白結(jié)合率的研究.pdf

1、狼毒為瑞香科植物瑞香狼毒Stellera chamaejasme L.、大戟科植物月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata或狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud.的干燥根，廣泛分布于我國(guó)東北、華北、西南等地區(qū)。狼毒有大毒，臨床上用于治療炎癥、水腫、皮膚病、結(jié)核和腫瘤等疾病。
　　目前，對(duì)于狼毒的研究主要集中于某一類(lèi)或幾種化學(xué)成分的提取、分離，而對(duì)其藥材及制劑中多組分的同時(shí)分析及體

2、內(nèi)代謝研究報(bào)道較少。本研究建立了微波輔助提取-UPLC-Q-TOF-MS/MS法鑒定瑞香狼毒中的化學(xué)成分，總結(jié)其質(zhì)譜裂解規(guī)律，為全面研究瑞香狼毒的化學(xué)組成和質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)；采用UPLC-Q-TOF-MS/MS法對(duì)東莨菪內(nèi)酯在大鼠尿液和膽汁中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，為東莨菪內(nèi)酯的臨床應(yīng)用提供重要參考；建立新型中空纖維離心超濾（HFCF-UF）技術(shù)聯(lián)合 HPLC法測(cè)定3種香豆素類(lèi)成分的蛋白結(jié)合率，為治療藥物監(jiān)測(cè)中蛋白結(jié)合率的研究提供有效手段

3、；建立微波輔助提取-離子液體分散液液微萃取-高效液相色譜法測(cè)定狼毒制劑結(jié)核靈片中6種組分的含量，為全面控制結(jié)核靈片的質(zhì)量提供新的手段。
　　第一部分微波輔助提取-UPLC-Q-TOF-MS/MS法鑒定瑞香狼毒中的化學(xué)成分
　　目的：建立微波輔助提取-UPLC-Q-TOF-MS/MS法鑒定瑞香狼毒藥材中的化學(xué)成分，并對(duì)其質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行總結(jié)。
　　方法：采用電噴霧離子源，在正、負(fù)離子模式下分別對(duì)對(duì)照品和供試品溶液進(jìn)行一級(jí)

4、和二級(jí)質(zhì)譜掃描，總結(jié)對(duì)照品的質(zhì)譜裂解規(guī)律。應(yīng)用“Peak View2.0”軟件中的“Master View”功能對(duì)瑞香狼毒供試品溶液的譜圖進(jìn)行分析，通過(guò)保留時(shí)間、質(zhì)譜裂解特征并參照文獻(xiàn)進(jìn)行瑞香狼毒中化合物結(jié)構(gòu)的推測(cè)、鑒定。色譜條件：采用C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm）；流動(dòng)相：A為含0.1％甲酸的水溶液，B為乙腈；梯度洗脫；柱溫25°C；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量2μL。
　　結(jié)果：共鑒定了瑞香狼毒中3

5、7種化合物（其中香豆素類(lèi)10種，黃酮類(lèi)25種，其它類(lèi)2種），并對(duì)其可能的裂解途徑進(jìn)行推測(cè)，總結(jié)質(zhì)譜裂解規(guī)律。
　　結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、快速，為全面研究瑞香狼毒的化學(xué)組成和質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)，為中藥材的定性鑒別提供有效手段。
　　第二部分 UPLC-Q-TOF-MS/MS法鑒定東莨菪內(nèi)酯在大鼠尿液和膽汁中的代謝產(chǎn)物
　　目的：建立UPLC-Q-TOF-MS/MS法鑒定東莨菪內(nèi)酯在大鼠尿液和膽汁中的代謝產(chǎn)物，探索東莨菪內(nèi)酯在

6、體內(nèi)的主要代謝途徑。
　　方法：采用電噴霧離子源，正離子模式監(jiān)測(cè)。色譜柱：C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm，）；柱溫：25°C；流動(dòng)相：水（含0.1%的甲酸）-乙腈（含0.1%的甲酸）；梯度洗脫；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：5μL。SD大鼠灌胃東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品后，分別收集0~72 h尿液和0~24 h膽汁，與空白生物樣品平行制備樣品并進(jìn)樣測(cè)定，應(yīng)用Metabolite Pilot1.5數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行

7、東莨菪內(nèi)酯代謝物的分析、鑒定。
　　結(jié)果：鑒定出東莨菪內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)可能的代謝產(chǎn)物7個(gè)，其中，尿液中代謝物7個(gè)、膽汁中3個(gè)，主要代謝途徑為去甲基化、羥基化、水解反應(yīng)、葡萄糖醛酸化和硫酸酯化。
　　結(jié)論：該方法專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高，為東莨菪內(nèi)酯體內(nèi)代謝過(guò)程的研究以及新的活性成分的發(fā)現(xiàn)提供了有效手段。
　　第三部分中空纖維離心超濾-高效液相色譜法測(cè)定3種香豆素類(lèi)成分的蛋白結(jié)合率
　　目的：建立新型中空纖維離心超濾（HF

8、CF-UF）技術(shù)聯(lián)合 HPLC法測(cè)定3種香豆素類(lèi)成分（巖白菜素、瑞香素和東莨菪內(nèi)酯）的蛋白結(jié)合率。
　　方法：將中空纖維切成長(zhǎng)度為15 cm的小段，分別用甲醇和超純水超聲清洗5s以除去雜質(zhì)，室溫晾干備用。將中空纖維彎成U型置于離心超濾玻璃管中，組成HFCF-UF裝置。取空白血漿900μL于1.5 mL離心管中，加入混合對(duì)照品溶液100μL，渦旋混合30 s，將其置于37°C水浴中預(yù)平衡30 min。取預(yù)平衡溶液400μL置于HFC

9、F-UF裝置中，將中空纖維兩端用封口膜固定，于10000 rpm離心10 min，取出中空纖維，用注射器推出中空纖維內(nèi)腔中的超濾液，注入HPLC儀，用于待測(cè)組分游離濃度的測(cè)定。同時(shí)另外取預(yù)平衡溶液400μL置于HFCF-UF裝置中，加入丙酮150μL，渦旋混合30 s后進(jìn)行HFCF-UF，用于待測(cè)組分總濃度的測(cè)定。根據(jù)藥物游離濃度和總濃度計(jì)算蛋白結(jié)合率。分析方法采用Diamonsil C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；

10、流動(dòng)相為甲醇：1%乙酸（pH=3.0）=35:65；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣體積20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm；柱溫為室溫。
　　結(jié)果：3種香豆素類(lèi)成分與血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)實(shí)現(xiàn)了良好分離。各待測(cè)組分線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r>0.9996，日內(nèi)精密度和日間精密度的RSD值分別小于3.3%和3.2%，相對(duì)回收率為97.6%~101.0%，絕對(duì)回收率為97.5%~100.9%。高、中、低3個(gè)濃度水平的QC樣品分別經(jīng)歷室溫放置24

11、h、-80°C凍存14天和3次凍融（-80°C放置24 h后解凍）循環(huán)后進(jìn)樣測(cè)定的RSD值分別小于4.3%、4.4%和4.4%。
　　結(jié)論：本研究建立了一種新型HFCF-UF-HPLC法測(cè)定3種香豆素類(lèi)成分的蛋白結(jié)合率。該方法通過(guò)向血漿樣品中加入丙酮作為蛋白結(jié)合釋放劑使藥物從藥物-蛋白復(fù)合物中釋放出來(lái)從而測(cè)定藥物總濃度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)藥物游離濃度和總濃度的平行制備與測(cè)定。與傳統(tǒng)的蛋白結(jié)合率的測(cè)定方法比較，該方法不需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理過(guò)程

12、而只需要簡(jiǎn)單的離心即可進(jìn)樣測(cè)定，藥物的蛋白結(jié)合平衡不被破壞，方法簡(jiǎn)單、靈密度高、回收率和重現(xiàn)性好。該方法的建立也為治療藥物監(jiān)測(cè)中同時(shí)測(cè)定藥物游離濃度、總濃度和蛋白結(jié)合率提供了有效手段。
　　第四部分微波輔助提取-離子液體分散液液微萃取-高效液相色譜法測(cè)定結(jié)核靈片中6種組分的含量
　　目的：建立簡(jiǎn)便、新穎、高效的微波輔助提取-離子液體分散液液微萃取結(jié)合HPLC法測(cè)定結(jié)核靈片中6種組分（瑞香素、東莨菪內(nèi)酯、傘型花內(nèi)酯、西瑞香素、

13、異茴芹內(nèi)酯和狼毒乙素）的含量。
　　方法：采用微波輔助提取-離子液體分散液液微萃取方法制備供試品溶液。分析方法采用Kromasil C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）和四氫呋喃：1%HAc=1:40, pH3.0（B），梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)325 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣體積20μL；柱溫為室溫。
　　結(jié)果：6種待測(cè)組分與供試品中其它干擾組分實(shí)現(xiàn)了良好分離。各組分的峰面積與濃度線(xiàn)

14、性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r大于0.9993。日內(nèi)精密度和日間精密度的 RSD值分別小于4.9%和4.9%。加樣回收率范圍為96.0%~103.8%，RSD小于4.0%。瑞香素、東莨菪內(nèi)酯、傘型花內(nèi)酯、西瑞香素、異茴芹內(nèi)酯和狼毒乙素的富集倍數(shù)分別為43、47、43、41、42和45倍。
　　結(jié)論：該方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、方便、環(huán)保、靈敏度高、溶劑消耗少、分析時(shí)間短、富集效率高。該方法的建立為結(jié)核靈片的質(zhì)量控制提供了有效的手段，為中藥材及其制劑