鱗翅目昆蟲Cry毒素受體與人類的同名蛋白的生物信息學分析及Cry2Aa蛋白的果蠅表達體系構建.pdf

1、第一部分鱗翅目昆蟲Cry毒素受體與人類的同名蛋白的生物信息學分析
　　背景：
　　Cry毒素是蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis, Bt)產生的一種殺蟲晶體蛋白，已廣泛應用于鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目等害蟲的生物防治。Cry毒素的殺蟲機制主要包括細胞穿孔模型和信號轉導細胞凋亡模型，雖然兩種模型仍有爭議，但Cry毒素受體在兩種模型中都具有重要的作用[1,2,3]。Cry毒素受體主要有氨肽酶 N（a

2、minopeptidase-N, APN）[4]、類鈣黏蛋白（Cadherin-like protein, CaLP）[5]、堿性磷酸酶(alkaline-phosphatase, ALP)[6]和糖脂類[7]。人體同樣存在APN、CaLP、ALP三種蛋白，其與鱗翅目昆蟲Cry毒素受體的異同以及是否具有Cry毒素受體的功能至今鮮見報道。利用生物信息學技術分析鱗翅目昆蟲Cry毒素受體APN、CaLP、ALP與人類的同名蛋白之間的關系，有利

3、于探討人體內是否存在 Cry毒素受體或類似物，為評價Cry毒素的安全性提供理論依據。
　　目的：
　　分析鱗翅目昆蟲Cry毒素受體氨肽酶N(APN)、類鈣黏蛋白(CaLP)、堿性磷酸酶(ALP)與人類的同名蛋白之間的關系，探討人體內是否存在Cry毒素受體或類似物。
　　方法：
　　從NCBI數據庫獲取人類和鱗翅目昆蟲的APN、CaLP、ALP的氨基酸序列，利用Clustalx1.83、Clustal Omega、

4、MEGA6.0、InterPro、SWISS-MODEL及FATCAT等軟件和在線服務器對序列一致性、系統(tǒng)發(fā)育關系、結構域、三維結構相似性等進行預測和分析。
　　結果：
　　APN系統(tǒng)發(fā)育關系最近的是人類與家蠶，兩者序列一致性最高58.06％、含2個相同的結構域、三維結構相似性顯著（62.80%，P﹤0.05），且兩者都含有潛在的O糖基化和N糖基化位點。ALP系統(tǒng)發(fā)育關系最近的是人類與家蠶，兩者序列一致性最高46.03%、含

5、2個相同的結構域、三維結構相似性顯著（59.63%和59.59%，P﹤0.05）。人類與鱗翅目昆蟲的CaLP系統(tǒng)發(fā)育關系較遠；CaLP序列一致性最高是人類與棉鈴蟲（28.12%），兩者含2個相同的結構域、三維結構相似性不顯著（18.75%， P﹥0.05）。
　　結論：
　　人類和家蠶的APN、ALP系統(tǒng)發(fā)育關系最近、序列一致性最高、含有相同的結構域且三維結構相似性顯著；人類與家蠶的APN均含有潛在的O糖基化和N糖基化位點。

6、因此，預測人類的APN、ALP與家蠶的APN、ALP可能具有相似的生物學功能。由于家蠶的APN、ALP具有Cry毒素受體的生物學功能，因此推測人類的APN、ALP也可能具有類似Cry毒素受體的功能，但仍需進一步實驗驗證。
　　第二部 Cry2Aa蛋白的果蠅表達體系構建
　　背景：
　　蘇云金芽孢桿菌產生的 Cry蛋白對鱗翅目、鞘翅目等昆蟲具有殺蟲活性，因而被作為有效的生物殺蟲劑廣泛應用于農林業(yè)害蟲的防治。隨著轉基因技術

7、的發(fā)展， Cry蛋白在抗蟲轉基因作物的應用也越來越多，目前國內外已成功培育出轉基因玉米、水稻、油菜、棉花等多種抗蟲轉基因作物。由于外源基因的插入可能會引起次級效應和位置效應，因此轉基因作物可能存在一些潛在的風險。目前，轉基因作物的食用安全性和生態(tài)安全性越來越受關注。其中，轉基因作物的過敏原性評價是研究重點之一，而獲得一定量的外源蛋白是進行過敏原性評價的基礎。另外，我們已經通過生物信息學預測人類的APN和ALP可能具有類似Cry毒素受體的

8、功能，進一步的實驗驗證需要 Cry蛋白作為實驗材料。果蠅表達系統(tǒng)結合了昆蟲表達系統(tǒng)和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)點，減少內毒素的影響，能夠直接產生高效且穩(wěn)定表達外源蛋白的昆蟲細胞系，具有較好的應用前景。
　　目的：
　　將Cry2Aa基因克隆進果蠅表達載體pAc5.1/V5-His中，構建Cry2Aa-pAc5.1瞬時轉染質粒。另外，在Cry2Aa基因的5’端添加一個帽子結構和Kozak序列從而獲得C2A33目的基因，并將其克隆

9、進果蠅表達載體pMK33/pMtHy中，構建C2A33-pMK33穩(wěn)定轉染質粒。將這兩種重組質粒分別采用瞬時轉染和穩(wěn)定轉染的方法轉入果蠅S2細胞，從而構建Cry2Aa蛋白的果蠅表達體系。表達的Cry2Aa蛋白可作為評價Cry2Aa蛋白過敏原性及實驗驗證人類的APN和ALP是否具有Cry毒素受體功能的實驗材料。
　　方法：
　　1、根據Cry2Aa基因序列和實驗要求設計PCR引物，由鉑尚生物技術（上海）有限公司合成。
　

10、　2、PCR擴增獲得Cry2Aa目的基因，將其克隆進pEASY–Blunt Simple Cloning Vector并進行菌落PCR和雙酶切鑒定；將鑒定正確的目的基因克隆進果蠅表達載體pAc5.1/V5-His中，構建Cry2Aa-pAc5.1瞬時轉染質粒，進行菌落PCR、雙酶切和測序鑒定。
　　3、PCR擴增獲得C2A33目的基因，將其克隆進pEASY–Blunt Simple Cloning Vector并進行菌落 PCR和

11、雙酶切鑒定；將鑒定正確的目的基因克隆進果蠅表達載體pMK33/pMtHy中，構建C2A33-pMK33穩(wěn)定轉染質粒，進行菌落PCR、雙酶切和測序鑒定。
　　結果：
　　1、構建了Cry2Aa蛋白的瞬時轉染質粒Cry2Aa-pAc5.1。
　　2、構建了Cry2Aa蛋白的穩(wěn)定轉染質粒C2A33-pMK33。
　　結論：
　　本研究構建了 Cry2Aa蛋白的瞬時轉染質粒 Cry2Aa-pAc5.1和穩(wěn)定轉染質粒