KIAA2018在骨肉瘤中的作用及其調控miRNAs的鑒定.pdf

1、目的：
　　骨肉瘤是一種以骨質破壞為特征的惡性腫瘤，是干細胞向成骨細胞分化過程中受遺傳或表觀遺傳變化影響的一種分化缺陷疾病。Runx2是骨肉瘤原癌基因，在骨肉瘤細胞中Runx2介導的成骨分化是紊亂的。KIAA2018隸屬于bHLH轉錄因子超家族，目前尚無文獻報道該基因的功能。在人bHLH家族中，KIAA2018與C亞類中的AP-1親緣關系最近，同屬于E-Box調節(jié)因子。AP-1能通過Runx2 P1基礎核心啟動子上DNase敏感區(qū)

2、域中的HLH/E-box（一種蛋白/DNA互作結構域），靶向調控骨肉瘤原癌基因Runx2的轉錄，此外，骨肉瘤中血管生成、骨肉瘤細胞遷移、侵襲、轉移等過程所需的關鍵因子也都是其直接調控的下游基因。miRNA可通過堿基互補配對原則識別靶基因3' UTR上結合位點，在轉錄后水平以mRNA降解或抑制蛋白翻譯的方式負調控靶基因，進而參與疾病發(fā)生等多種生理過程。哺乳動物中，大約90％的基因可受miRNA的調控。本研究的目的是:1）在人骨肉瘤Saos

3、-2細胞中抑制KAA2018表達，研究其對骨肉瘤原癌基因Runx2轉錄的影響;2）鑒定調控KIAA2018的miRNAs;3）篩選KIAA20183'UTR區(qū)的miRNA相關SNP。
　　方法：
　　1.通過shRNA慢病毒介導構建KIAA2018基因敲降型Saos-2細胞模型，qPCR檢測對照組Saos-2細胞和KIAA2018敲降型Saos-2細胞中Runx2在mRNA水平上的差異。
　　2.運用Diaua-mic

4、roT、miRanda、miRDB、PICTAR、PITA、RNA22、RNAhybrid、Targetscan、miRWalk9種miRNA靶基因分析工具，預測可能調控人KIAA2018的miRNA，后運用熒光素酶報告基因法進行實驗驗證;之后，再進一步合成相應miRNA的模擬物和抑制劑轉染293T細胞，利用qPCR檢測內源性miR-27a的表達變化對KIAA2018的影響。
　　3.首先運用miRNASNPv2.0、mrSNP和

5、SNPinfo篩選KIAA20183'UTR區(qū)的miRNA相關SNP，然后對候選SNP分別構建插入野生型KIAA20183'UTR和突變型KIAA20183'UTR的psi-CHECK2重組表達載體以及插入相應pre-miRNA的pCMV-MIR重組載體，最后運用雙熒光素酶報告基因法進行檢測。
　　結果：
　　1.利用PHBLV-U6-GFP-T2A-Puro慢病毒載體系統(tǒng)，成功構建了KIAA2018基因敲降型Saos-2細

6、胞模型，qPCR結果顯示與正常Saos-2細胞相比，KIA2018基因敲降型Saos-2細胞中RUNX2的mRNA水平降低至約34％。
　　2.運用Diana-microT、miRanda、miRDB、PICTAR、PITA、RNA22、RNAhybrid、Targetscan和miRWalk分析KIAA2018基因，Diana-microT、miRanda、miRDB和TargetSacan顯示KIAA2018可能受miR-27

7、a、miR-96、miR-199a和miR-216a調控;而分析這4個miRNA可能的靶基因時，只有miR-27a的靶基因中含有KIAA2018。TargetScan分析結果揭示miR-27a成熟序列中與KIAA2018作用的8個堿基在脊椎動物中高度保守。雙熒光素酶報告基因檢測證實miR-27a調控KIAA2018的表達。進一步檢測miR-27a對內源性KIAA2018轉錄的影響，qPCR結果顯示轉染miR-27amimics提高內源性

8、miR-27a表達，引起KIAA2018 mRNA水平下調40.4％(p＜0.01）;而轉染miR-27a inhibitor抑制內源性miR-27a表達，引起KIAA2018 mRNA水平上調39.8％(p＜0.01)。
　　3.KIAA20183'UTR區(qū)上的兩個SNP rs9814605(chr3:113372048，T/C)和SNPrs13065268(chr3:113372047，G/A)能影響miR-513a-5p與K

9、IAA2018的結合。當SNPrs9814605位點由T→C時，miR-513a-5p不能與KIAA2018結合(p＜0.01）;當SNPrs13065268位點由G→A時，miR-513a-5p不能與KIAA2018結合(p＜0.01)。熒光素酶報告基因實驗檢測結果與預測一致，且發(fā)現(xiàn)當rs9814605為T等位基因，同時rs13065268為G等位基因時，它們共同引起的miR-513a-5p對KIAA2018的下調作用顯著增強。