林生地霉體內(nèi)及體外藥物敏感性研究.pdf

1、目的:林生地霉（Geotricum sivicola）作為地霉屬中較罕見的一個(gè)種，是新近發(fā)現(xiàn)的條件致病菌。自2002年及2005年，我科先后從一例膿癬患者皮損處，及一例中毒性表皮壞死松解癥患者血液中分離出林生地霉后，首次證實(shí)了林生地霉可以感染人類甚至引起系統(tǒng)感染[1-2]。據(jù)報(bào)道，近年來?xiàng)l件致病菌引起人類感染的病例逐年增加，這一現(xiàn)象緣于免疫低下宿主群體數(shù)目的逐漸龐大、抗生素的不合理使用、放化療技術(shù)的廣泛應(yīng)用和各種侵入性檢查及外科手術(shù)的發(fā)

2、展，所以條件致病菌，尤其是罕見條件致病菌引起的感染事件應(yīng)引起足夠重視。在臨床工作中條件致病菌感染的治療效果欠佳，雖然目前藥品市場上有多種抗真菌藥物可供選擇，但各類藥物對(duì)不同真菌的敏感性差異較大，耐藥菌株的報(bào)道亦逐年增多。所以，及時(shí)發(fā)現(xiàn)條件致病菌種，并研究尋找對(duì)其敏感的藥物，以指導(dǎo)日后相關(guān)臨床工作顯得尤為重要。
　　我科已將林生地霉的生物學(xué)特性、致病性等進(jìn)行了較詳盡的研究，但關(guān)于林生地霉感染的敏感性藥物，在國內(nèi)及國際上尚無相關(guān)依據(jù)。

3、本研究一方面采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法，通過比較各用藥組小鼠脾臟組織真菌逆培養(yǎng)陽性率的變化及脾臟組織載菌量的變化，以分析在動(dòng)物體內(nèi)林生地霉對(duì)臨床常用抗真菌藥物的敏感性。另一方面，采用了美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)于2002年修訂完成的M27-A2方案推薦的肉湯稀釋法[3]對(duì)各抗真菌藥物，即特比萘芬(TER)、兩性霉素B（AmB）、氟胞嘧啶(5-FC)、氟康唑(FCZ)和伊曲康唑(ICZ)對(duì)林生地霉的最低抑菌濃度（MIC值）進(jìn)行測定。

4、林生地霉屬酵母樣真菌，可用NCCLS推薦的抗真菌藥物對(duì)酵母樣真菌敏感性的界定標(biāo)準(zhǔn)來對(duì)實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果進(jìn)行評(píng)判，從而得到林生地霉在體外對(duì)該五種抗真菌藥物的敏感性。此方法為目前世界上公認(rèn)的最具權(quán)威性的藥敏實(shí)驗(yàn)方法。本實(shí)驗(yàn)對(duì)林生地霉的藥物敏感性進(jìn)行深化研究，對(duì)臨床上林生地霉感染的治療具有一定的指導(dǎo)意義。
　　方法:
　　1、動(dòng)物體內(nèi)的藥敏實(shí)驗(yàn)
　　1.1林生地霉感染動(dòng)物模型的制作
　　將小鼠隨機(jī)分為特比萘芬治療組、兩性霉素

5、B治療組、5-氟胞嘧啶治療組、氟康唑治療組、伊曲康唑治療組和未治療組，每一小組又分為逆培養(yǎng)陽性率觀察組和組織載菌量觀察組，通過給小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺的方法，制作免疫低下小鼠模型，后將菌懸液通過腹腔注射的途徑接種到小鼠體內(nèi)，制作成為林生地霉感染的動(dòng)物模型[4]。
　　1.2給藥途徑及給藥量
　　各抗真菌藥物因?yàn)椴煌o藥途徑會(huì)導(dǎo)致在動(dòng)物體內(nèi)吸收率不同，所以選擇其吸收率最高的給藥途徑，結(jié)合藥典給出的用藥劑量，自菌懸液接種2小時(shí)后給

6、藥，1天1次，連續(xù)5天[5]。
　　1.3組織真菌逆培養(yǎng)
　　給藥結(jié)束后將小鼠處死，分離其脾臟組織，行組織真菌逆培養(yǎng)，計(jì)算其各組逆培養(yǎng)陽性率，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　1.4組織載菌量測定
　　將各組小鼠處死后解剖，將脾臟于組織研磨器中研碎，行組織載菌量測定，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　2、抗真菌藥物對(duì)林生地霉MIC值的測定
　　2.1菌懸液的制備
　　將菌種復(fù)蘇并轉(zhuǎn)種后在無菌條件下，用生理鹽水沖洗平面

7、，在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，再用RPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋，最終得到濃度為1～5×105cfu/ml的林生地霉菌懸液及質(zhì)控菌株菌懸液作為接種物。
　　2.2抗真菌藥物接種液的制備
　　根據(jù)NCCLS M27-A2方案，將各抗真菌藥物分別溶解，配成各藥物的貯存液，保存于-20℃冰箱里備用，使用時(shí)常溫下解凍并用RPMI-1640液體培養(yǎng)基倍比稀釋為10個(gè)遞減濃度為藥物的接種濃度。
　　2.3藥液及菌懸液的接種
　　

8、將遞減濃度的各組藥液依次加入96孔板的1～10列，將不含藥物的培養(yǎng)基加入11～12列，后將菌懸液依次加入1～11列中，同時(shí)在第12列再加入液體培養(yǎng)基，即96孔板中1～10列為藥物實(shí)驗(yàn)組，11列為生長對(duì)照組，12列為空白對(duì)照組。在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后讀取數(shù)據(jù)。
　　2.4結(jié)果判讀
　　結(jié)合NCCLS M27-A2方案給出的建議，判讀5種抗真菌藥物對(duì)受試菌及質(zhì)控菌的MIC值，將測得的質(zhì)控菌的MIC值與其參考范圍進(jìn)行對(duì)比，

9、在參考范圍內(nèi)才可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)有效，并將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　結(jié)果:
　　1、動(dòng)物體內(nèi)藥敏實(shí)驗(yàn)
　　1.1組織真菌逆培養(yǎng)陽性率比較
　　特比萘芬治療組、兩性霉素B治療組及5-氟胞嘧啶治療組與未治療組比較均有明顯差異(P＜0.05)，而氟康唑治療組及伊曲康唑治療組的逆培養(yǎng)陽性率與未治療組比較無明顯差(P＞0.05);其中，特比萘芬組陽性率較其他組均低，兩兩比較均有顯著性差異(P＜0.05)(Table3)。

10、>　　1.2組織載菌量比較
　　特比萘芬治療組、兩性霉素B治療組、5-氟胞嘧啶治療組及氟康唑治療組與未治療組脾臟載菌量比較，載菌量均較低，有明顯差異(P＜0.05)，而伊曲康唑治療組與未治療組載菌量比較，無明顯差異(P＞0.05);特比萘芬治療組與5-氟胞嘧啶治療組、氟康唑治療組比較，載菌量最低，有明顯差異(P＜0.05);5-氟胞嘧啶治療組與氟康唑治療組小鼠脾臟載菌量比較，無明顯差異（P＞0.05）(Table4)。
　　

11、2、抗真菌藥物對(duì)林生地霉的MIC值(μg/ml)
　　特比萘芬:0.01、兩性霉素B:0.4、5-氟胞嘧啶:2、氟康唑:2.69、伊曲康唑:0.25。林生地霉對(duì)它們的敏感性分別為:對(duì)特比萘芬、兩性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑均為敏感，對(duì)伊曲康唑?yàn)閯┝恳蕾囆悦舾?Table5)。
　　結(jié)論:
　　1、特比萘芬、兩性霉素B及5-氟胞嘧啶均可有效降低林生地霉感染的脾臟組織逆培養(yǎng)陽性率，其中以特比萘芬效果最強(qiáng)，而氟康唑和伊曲康