SF-1甲基化異常在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生中的作用及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道常見三大惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率居高不下，且病死率呈上升趨勢(shì)。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展是內(nèi)外多種因素相互作用的結(jié)果，長(zhǎng)期雌激素刺激是其主要危險(xiǎn)因素。研究表明，在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展中存在DNA甲基化異常，低甲基化是腫瘤發(fā)生過(guò)程中的早期的表觀遺傳學(xué)改變。
　　SF-1基因是雌激素生物合成重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠激活膽固醇遷移和類固醇生成所涉及的基因表達(dá)，在類固醇激素的生物合成過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。那么SF-1基因

2、是否在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用并受到甲基化調(diào)控？這種作用又是通過(guò)何種分子機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)的？
　　因此本研究首先在組織水平檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌SF-1表達(dá)及其基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)；然后通過(guò)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，探討SF-1基因甲基化異常對(duì)子宮內(nèi)膜癌生物學(xué)行為的影響及其分子機(jī)制，將從新的分子靶點(diǎn)探尋子宮內(nèi)膜癌的生物學(xué)標(biāo)志物，為子宮內(nèi)膜癌的有效診治策略提供可借鑒的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分子宮內(nèi)膜癌組織中SF-1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及其臨床意義

3、r>　　目的:
　　檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌組織、癌旁組織和正常子宮內(nèi)膜組織中SF-1蛋白和甲基化相關(guān)蛋白DNMTs的表達(dá)以及SF-1基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)，探討子宮內(nèi)膜癌組織中SF-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　方法:
　　1.采用免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)正常子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織中SF-1蛋白的表達(dá)情況。
　　2.采用western blot方法，檢測(cè)正常子宮內(nèi)膜組織、子宮

4、內(nèi)膜癌及癌旁組織中SF-1蛋白和DNMTs蛋白的表達(dá)水平。
　　3.分析子宮內(nèi)膜癌組織中，SF-1蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系。
　　4.采用BSP方法，檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織中SF-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果:
　　1. IHC顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中SF-1蛋白表達(dá)明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；且同一病例中子宮內(nèi)膜癌組織 SF-1表達(dá)顯著高于子宮內(nèi)膜癌旁組織，差異具

5、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。
　　2. WB結(jié)果顯示，在子宮內(nèi)膜癌組織中，SF-1蛋白呈高表達(dá)，和癌旁組織比較，差異有顯著性（P<0.05），和正常內(nèi)膜組織比較，差異有極顯著性（P<0.01）。甲基化相關(guān)蛋白DNMT3a和DNMT3b在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)明顯低于子宮內(nèi)膜癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3．在不同病理類型、不同病理分級(jí)的子宮內(nèi)膜癌中，SF-1蛋白的表達(dá)水平不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.

6、05）。腫瘤組織病理分級(jí)越高，其 SF-1表達(dá)水平越高；特殊類型子宮內(nèi)膜癌中 SF-1表達(dá)明顯高于子宮內(nèi)膜樣腺癌。
　　4. BSP結(jié)果顯示，甲基化胞嘧啶百分比在子宮內(nèi)膜癌組織（8.2％）明顯低于癌旁組織（40.9%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明SF-1基因啟動(dòng)子在子宮內(nèi)膜癌組織呈低甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)論:
　　1. SF-1在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起促進(jìn)作用，其異常高表達(dá)與患者的不良預(yù)后有關(guān)。

7、r>　　2. SF-1基因啟動(dòng)子區(qū)的異常低甲基化可能是其蛋白表達(dá)水平升高的原因，SF-1基因啟動(dòng)子低甲基化狀態(tài)在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制中可能起著重要的作用。
　　第二部分 SF-1基因啟動(dòng)子甲基化異常對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　目的:
　　利用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-2′-deoxycytidine（5-Aza-CdR）處理子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞后，使 SF-1去甲基化，研究 SF-1基因啟動(dòng)子甲基化異常對(duì)

8、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞SF-1表達(dá)及生物學(xué)行為的影響。
　　方法:
　　1.以子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1-A，RL95-2為研究對(duì)象，分別加以不同濃度的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR，每種細(xì)胞系分成不同濃度的5-Aza-CdR組和未經(jīng)任何處理的對(duì)照組。
　　2.采用EdU熒光標(biāo)記法測(cè)定不同濃度5-Aza-CdR組處理后的細(xì)胞增殖情況。
　　3. Western blot方法檢測(cè)不同濃度5-Aza-CdR組和對(duì)照組細(xì)胞

9、中SF-1表達(dá)的差異。
　　4. BSP法檢測(cè)5-Aza-CdR處理后細(xì)胞SF-1基因啟動(dòng)子甲基化水平。
　　5.采用qPCR法檢測(cè)5-Aza-CdR處理細(xì)胞后SF-1下游靶基因StAR, HSD3β2和CYP19A1 mRNA的表達(dá)。
　　6.通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)5-Aza-CdR組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡的情況，以及采用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和細(xì)胞周期蛋白Cyc

10、lin D3的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.根據(jù) EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果，低濃度5-Aza-CdR對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞有促進(jìn)增殖作用，高濃度5-Aza-CdR對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，抑制細(xì)胞增殖（P<0.05）。
　　2. Western blot結(jié)果顯示，在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1-A和RL95-2中，SF-1蛋白呈一定水平的表達(dá)，經(jīng)過(guò)5-Aza-CdR處理后兩種細(xì)胞株均表現(xiàn)為SF-1表達(dá)升高，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

11、<0.05）。
　　3. BSP測(cè)序結(jié)果顯示，低濃度5-Aza-CdR明顯降低SF-1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化水平（P<0.05）。
　　4.通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，5-Aza-CdR處理后SF-1下游靶基因StAR, HSD3β2和CYP19A1 mRNA的表達(dá)明顯增高（P<0.05）。
　　5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，低濃度5-Aza-CdR組細(xì)胞凋亡明顯減少，高濃度5-Aza-Cd

12、R組細(xì)胞凋亡明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　6.細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，1.0 uM5-Aza-CdR處理后細(xì)胞Bcl-2表達(dá)明顯增加，Bcl-2/Bax比值增加，或Caspase-3表達(dá)明顯降低（P<0.05）；5.0 uM5-Aza-CdR處理后Bax表達(dá)極顯著升高（P<0.01），或Bcl-2表達(dá)明顯降低，Bcl-2/Bax比值下降， Caspase-3表達(dá)明顯

13、升高（P<0.05）。
　　7.細(xì)胞周期蛋白 Cyclin D3的表達(dá)檢測(cè)顯示，1.0 uM和2.5 uM的5-Aza-CdR作用后，細(xì)胞HEC-1-A和RL95-2中Cyclin D3的表達(dá)均明顯增加（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.通過(guò)5-Aza-CdR抑制SF-1基因啟動(dòng)子甲基化水平后，能促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞SF-1表達(dá)，說(shuō)明子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞SF-1高表達(dá)與SF-1基因啟動(dòng)子區(qū)去甲基化有關(guān)。
　　2. S