國產(chǎn)多孔鉭對成骨生物學(xué)效應(yīng)影響機制的體外研究.pdf

1、本文從以下幾章進行探討：
　　第一章 國產(chǎn)多孔鉭對兔成骨細胞生物學(xué)行為及功能影響的研究
　　目的:通過對國產(chǎn)多孔鉭支架材料的物理特性、與成骨細胞復(fù)合培養(yǎng)后成骨細胞增殖、細胞周期、成骨性細胞因子分泌功能影響的研究，探討國產(chǎn)多孔鉭支架材料的生物相容性及在修復(fù)骨缺損、骨再生中的作用。
　　方法:掃描電鏡觀察國產(chǎn)多孔鉭支架材料表面和內(nèi)部的形貌特征。取新生乳兔顱蓋骨成骨細胞進行分離、培養(yǎng)及鑒定，以DMEM為浸提介質(zhì)根據(jù)國標制備鉭

2、浸提液，將多孔鉭支架材料高溫高壓滅菌。隨機取第3代成骨細胞分為三組，A組為單純成骨細胞培養(yǎng)組，B組為多孔鉭浸提液與成骨細胞培養(yǎng)組，C組為多孔鉭支架材料與成骨細胞復(fù)合培養(yǎng)組。CCK-8法檢測三組成骨細胞生長增殖情況，檢測多孔鉭支架材料對細胞毒性及增殖的影響。倒置相差顯微鏡、掃描電鏡、透射電鏡觀察成骨細胞在多孔鉭支架材料上的形態(tài)結(jié)構(gòu)，生長、粘附、增殖情況。流式細胞儀檢測多孔鉭支架材料上生長的成骨細胞的細胞周期。采用ELISA試劑盒，檢測三組

3、成骨細胞培養(yǎng)后3、5、7天骨鈣素與一型膠原的分泌。
　　結(jié)果:國產(chǎn)多孔鉭支架材料表面及斷面可見針尖大小，分布均勻的蜂窩狀孔隙。掃描電鏡下觀察可見支架材料表面與斷面上分布直徑20-50μm的微粒，微粒間存在直徑400-600μm的孔隙，孔隙間相互連通呈網(wǎng)狀，類似于骨松質(zhì)構(gòu)架。CCK-8法檢測結(jié)果:隨培養(yǎng)時間的延長，三組成骨細胞生長狀態(tài)良好，無明顯差異，成骨細胞形態(tài)正常，貼壁增殖良好，發(fā)現(xiàn)各組各時間點的細胞增殖差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。倒置

4、相差顯微鏡觀察成骨細胞與多孔鉭支架材料復(fù)合培養(yǎng)可見多孔鉭支架材料邊緣粘附大量成骨細胞;掃描電鏡觀察可見成骨細胞在多孔鉭支架材料表面及內(nèi)部孔隙內(nèi)生長、粘附、增殖，形態(tài)多樣，細胞相互連接，并分泌大量細胞外基質(zhì)，基質(zhì)連接呈片狀，逐步覆蓋材料;透射電鏡觀察可見成骨細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)大小形態(tài)正常，無明顯變化。細胞周期檢測結(jié)果提示三組細胞均為正常二倍體細胞，三組細胞周期分布相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。隨機抽取各時間點各組細胞進行分泌功能的檢測，結(jié)果顯示三組

5、細胞均有骨鈣素與Ⅰ型膠原的分泌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨培養(yǎng)時間延長，細胞骨鈣素分泌逐漸增多。多孔鉭支架組骨鈣素分泌較其他兩組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;鉭浸提液組與正常培養(yǎng)液組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各組Ⅰ型膠原分泌結(jié)果顯示實驗初期隨時間增加Ⅰ型膠原分泌量增多，5d出現(xiàn)高峰，之后開始下降，同一時間點三組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;各組組內(nèi)不同時間點比較，結(jié)果顯示三組不同時間點比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義;多重比較顯示除多孔鉭支架組組內(nèi)3d和7d無統(tǒng)計學(xué)差異，其余組

6、間比較均有統(tǒng)計差異。
　　結(jié)論:國產(chǎn)多孔鉭支架材料具備良好的生物相容性;成骨細胞與多孔鉭支架復(fù)合培養(yǎng)后骨鈣素分泌增多，提示多孔鉭支架材料可能促進成骨細胞的礦化及成骨作用。
　　第二章 國產(chǎn)多孔鉭對成骨因子及成骨轉(zhuǎn)錄因子表達影響的研究
　　目的:通過檢測成骨細胞與國產(chǎn)多孔鉭支架材料復(fù)合培養(yǎng)后的成骨因子骨鈣素、Ⅰ型膠原、骨橋蛋白、纖維粘連蛋白以及成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx-2、OSX、P38 MAPK的表達變化情況，探討國產(chǎn)多孔

7、鉭支架材料對成骨細胞的成骨效應(yīng)影響的作用機制。
　　方法:隨機取第3代成骨細胞分為三組，A組為單純成骨細胞培養(yǎng)組（正常培養(yǎng)液組），B組為多孔鉭浸提液與成骨細胞培養(yǎng)組，C組為多孔鉭支架材料與成骨細胞復(fù)合培養(yǎng)組。分別取培養(yǎng)5d的三組細胞進行細胞爬片，采用免疫細胞化學(xué)染色法測定成骨因子Col-1、OC、FN、OPN及成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx-2、OSX、P38 MAPK的表達情況;并對多孔鉭支架組細胞進行免疫細胞熒光化學(xué)染色法檢測成骨因子O

8、PN與成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx-2、OSX，P38 MAPK與Runx-2、OSX的共表達情況。分別提取培養(yǎng)5d的三組細胞的蛋白及RNA分別采用免疫細胞蛋白印跡法及實時熒光定量PCR法檢測Col-1、OC、FN、OPN及Runx-2、OSX、P38 MAPK蛋白及mRNA表達情況。
　　結(jié)果:免疫細胞化學(xué)染色檢測培養(yǎng)5d的各組細胞成骨因子表達情況發(fā)現(xiàn)，在正常培養(yǎng)液組、鉭浸提液組及多孔鉭支架組均存在OC、Col-1、FN、OPN、Run

9、x-2、OSX、p-P38（磷酸化的P38）的陽性細胞的表達，細胞胞漿內(nèi)可見棕黃色顆粒，多孔鉭支架組各因子的表達均較其他兩組有升高趨勢，尤其是OC、OPN、Runx-2、OSX的表達較其他兩組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫熒光細胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)多孔鉭支架組存在Runx-2、OSX分別與OPN共表達情況，通過熒光染劑標記Runx-2、OSX在細胞胞漿內(nèi)呈綠色，OPN呈紅色，多孔鉭支架組的成骨細胞中存在Runx-2、OSX分別與OPN共表達

10、的情況，胞漿呈黃綠色;同時還可見p-P38熒光染色為紅色，同時分別標記Runx-2、OSX綠色后可與p-P38熒光雙標，發(fā)現(xiàn)還存在p-P38分別與Runx-2、OSX的共表達，胞漿呈黃綠色的情況。免疫細胞蛋白印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組細胞各因子蛋白表達情況與免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果基本一致。
　　結(jié)論:國產(chǎn)多孔鉭支架材料可通過影響成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx-2、OSX的表達，影響成骨因子Col-1、OPN、OC、FN表達最終促進成骨細胞增殖、生長與礦

11、化，促進成骨，是較理想的骨移植替代材料。
　　第三章 國產(chǎn)多孔鉭與成骨細胞相互作用機制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　目的:采用以同位素相對標記與絕對定量技術(shù)(iTRAQ)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析MG63細胞在正常培養(yǎng)液、鉭浸提液以及多孔鉭支架材料，三種不同的培養(yǎng)環(huán)境下蛋白表達的改變，查找并探討分析多孔鉭支架材料的三維立體結(jié)構(gòu)對成骨細胞影響的相關(guān)因子及其作用機制，同時對前期工作進行印證。
　　方法:取生長狀態(tài)良好的第3代MG63細胞

12、，隨機分為三組，A組為正常培養(yǎng)液組，B組為鉭浸提液組，C組為多孔鉭支架材料組。每組接種相同數(shù)量的MG63細胞。A組MG63細胞采用MEM培養(yǎng)液培養(yǎng);B組MG63細胞采用鉭浸提液培養(yǎng);C組取高溫高壓滅菌的多孔鉭支架材料，MEM培養(yǎng)液浸潤后將MG63細胞懸液滴到多孔鉭支架材料表面，在37℃、5％CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)2h，將材料翻轉(zhuǎn)，滴加MG63細胞懸液25μl于材料的另一面，在37℃、5％CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)2h

13、，將支架材料移入一新孔內(nèi)，加入MEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。三組培養(yǎng)板于37℃、5％CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2d更換1次培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)7天。CCK-8法檢測細胞增值情況。掃描電鏡觀察多孔鉭支架上細胞生長狀態(tài)。提取各組細胞蛋白，采用Bradford法蛋白定量，提取部分蛋白進行雙向熒光凝膠差異電泳，檢查蛋白提取及定量情況以及三樣本間差異狀況，初步分析蛋白樣本情況。
　　結(jié)果:MG63細胞在正常培養(yǎng)液、鉭浸提液以及多孔鉭支架材料三種

14、環(huán)境下培養(yǎng)，細胞生長狀態(tài)良好，細胞形態(tài)單一化，呈多角形或長梭形;ALP染色結(jié)果陽性。經(jīng)析因方差分析不同時間下正常培養(yǎng)液組、鉭浸提液組和多孔鉭支架組CCK-8法檢測細胞活性O(shè)D值的結(jié)果。組間OD值差異無顯著性意義。不同時間間差異有顯著性意義。分組和時間之間存在交互作用。單獨效應(yīng):固定時間進行組間比較，結(jié)果顯示除7d外其余時間三組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。掃描電鏡觀察，多孔鉭支架材料組細胞在材料表面以及材料孔隙間粘附生長，初期細胞排列較稀疏;

15、隨時間增加相鄰細胞互相連接，逐步覆蓋大部分材料表面，并延伸入孔隙當中;后期細胞分泌大量基質(zhì)，逐步覆蓋材料表面。提取三組細胞蛋白進行定量分析，凝膠電泳結(jié)果提示三組樣本條帶清晰、多根、分布均勻、無明顯高豐度，符合進行試驗的標準。雙向熒光差異電泳發(fā)現(xiàn)三樣本間存在明顯的差異點，達到iTRAQ試驗的標準。iTRAQ實驗結(jié)果根據(jù)原始數(shù)據(jù)的p-value，選取p≤0.05進行過濾后，差異倍數(shù)≥1.5或差異倍數(shù)≤0.666，所得結(jié)果進入分析，鑒定到鉭浸

16、提液組與正常培養(yǎng)液組比較差異蛋白有56個;多孔鉭支架材料組與正常培養(yǎng)液組比較差異蛋白有150個。將差異蛋白數(shù)據(jù)Map到DAVID的數(shù)據(jù)庫中，鉭浸提液組與正常培養(yǎng)液組比較差異，有6個不能識別，數(shù)據(jù)庫識別有記錄信息的有50個，其中上調(diào)蛋白35個，下調(diào)蛋白15個，開展GO功能注釋，通過對差異蛋白參與的生物學(xué)過程、具備的分子功能以及蛋白質(zhì)所屬細胞成分的分析，篩選出與本實驗相關(guān)的差異蛋白上調(diào)蛋白6個，下調(diào)蛋白2個;多孔鉭支架材料組與正常培養(yǎng)液組差

17、異比較蛋白，有26個不能識別，數(shù)據(jù)庫識別有記錄信息的有124個，其中上調(diào)蛋白104個，下調(diào)蛋白20個，開展GO功能注釋，通過對差異蛋白參與的生物學(xué)過程、具備的分子功能以及蛋白質(zhì)所屬細胞成分的分析，篩選出與本實驗相關(guān)的差異蛋白上調(diào)蛋白12個，下調(diào)蛋白1個。同時發(fā)現(xiàn)驅(qū)動蛋白-1，肌動蛋白，角蛋白10具有一致性差異表達;多孔鉭支架材料組出現(xiàn)細胞骨架相關(guān)蛋白，凝溶膠，過氧化氫酶，磷脂酶A2，整合素β-1，鈣結(jié)合蛋白A4，細胞外基質(zhì)蛋白-1的差異

18、上調(diào)。
　　結(jié)論:經(jīng)過同位素相對標記與絕對定量技術(shù)，篩選出多孔鉭支架組與鉭浸提液組以及正常培養(yǎng)液組的差異蛋白，驗證前期工作的同時，揭示多孔鉭材料與細胞相互作用機制，前期工作提示細胞在多孔鉭的三維立體結(jié)構(gòu)上細胞增殖，粘附能力增強，細胞基質(zhì)分泌增多，通過蛋白組學(xué)技術(shù)分析多孔鉭支架材料組出現(xiàn)的大部分差異蛋白主要參與細胞粘附、運動、分泌過程，說明多孔鉭的三維立體空間結(jié)構(gòu)、高孔隙率和內(nèi)部微孔結(jié)構(gòu)可增強細胞粘附、分泌的能力，進一步為國產(chǎn)多孔鉭