多壁碳納米管生物學(xué)效應(yīng)的分子機(jī)制研究.pdf

1、近年來，有關(guān)納米技術(shù)(Nanotechnology)的研究蓬勃發(fā)展。現(xiàn)今，國(guó)際上關(guān)于納米技術(shù)的專業(yè)學(xué)術(shù)期刊已有近60種，這些刊物的影響因子年年攀升，從中可見本領(lǐng)域研究的熱度。納米技術(shù)的發(fā)展高度依賴具有良好性質(zhì)的納米材料的開發(fā)以及其理化性質(zhì)的改造。碳納米管是一種由單層或多層石墨片層卷曲而成的空心柱狀碳納米材料，其優(yōu)良的理化性質(zhì)日益引起人們的關(guān)注。研究表明，碳納米管在多個(gè)科技領(lǐng)域都具有極大的應(yīng)用潛力。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，近年的研究亦證實(shí)，碳納米

2、管是一種優(yōu)良的藥物載體，具有載藥量大、可方便地實(shí)現(xiàn)藥物的緩控釋、能實(shí)現(xiàn)多功能化等引人入勝的特點(diǎn);另外，它還是一種具有低背景噪音的成像對(duì)比劑及高強(qiáng)度的組織工程基質(zhì)材料，同時(shí)，其獨(dú)特的光學(xué)、熱學(xué)性質(zhì)還可直接用于殺滅腫瘤細(xì)胞。雖然納米粒子對(duì)于人類而言早已不陌生（自然界中存在諸多天然的納米粒子），但人類對(duì)其生物學(xué)性質(zhì)的了解還相當(dāng)有限，因此人們對(duì)潛在的納米毒副作用予以很大的關(guān)注。研究顯示，碳納米管的主要毒副作用包括導(dǎo)致細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生、誘導(dǎo)炎癥、

3、引起細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，以及導(dǎo)致石棉樣毒性等。
　　 碳納米管的應(yīng)用潛力及毒性的發(fā)生都是在與細(xì)胞相互作用的過程中產(chǎn)生的?，F(xiàn)在人們已經(jīng)掌握了碳納米管在組織與細(xì)胞水平上的部分生物學(xué)性質(zhì)，其中包括經(jīng)由不同途徑（例如口服、靜脈注射、透皮吸收，以及呼吸作用等）進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后在各器官分布的規(guī)律，納米材料進(jìn)入細(xì)胞的途徑和在亞細(xì)胞水平上的定位，以及影響納米材料分布、吸收、代謝以及排泄等過程的理化因素等，但在更進(jìn)一步的分子層次上的

4、研究則相對(duì)比較缺乏。在這方面，研究最多的是碳納米管與蛋白質(zhì)的相互作用，例如碳納米管表面性質(zhì)對(duì)血清蛋白的吸附規(guī)律。這些分子水平上的研究對(duì)了解碳納米管的基本生物學(xué)性質(zhì)具有重要的指導(dǎo)意義，但是，由于大部分研究是在試管內(nèi)進(jìn)行的，研究結(jié)果無法反映碳納米管與活細(xì)胞作用時(shí)的真實(shí)情況。例如，膜結(jié)合蛋白的功能化立體構(gòu)像需要細(xì)胞膜的支撐作用，一旦這些蛋白離開細(xì)胞膜，其結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生改變。因此，研究納米材料在活細(xì)胞中與生物分子的相互作用具有實(shí)際的生物學(xué)意義。<

5、br>　　 本論文的第一部分（第2章）內(nèi)容是開發(fā)三種用于研究在活細(xì)胞內(nèi)多壁碳納米管（以及其他納米材料）與細(xì)胞膜蛋白相互作用的方法。很多細(xì)胞膜蛋白參與細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)控，有研究顯示納米材料影響細(xì)胞信號(hào)通路的傳導(dǎo)。納米材料與細(xì)胞接觸后分布于細(xì)胞膜上或進(jìn)入細(xì)胞，因此，其影響細(xì)胞信號(hào)通路的作用靶點(diǎn)可能是細(xì)胞膜上的蛋白受體，也可能是細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)步驟。雖然后一情況已有少量研究報(bào)導(dǎo)，納米材料是否會(huì)作用于細(xì)胞膜上的蛋白受體仍然未知，這在一定程度上

6、是由于缺乏有效的研究方法。這部分研究?jī)?nèi)容是借鑒生物學(xué)中用于研究生物大分子之間相互作用的方法來研究多壁碳納米管與細(xì)胞膜受體之間的相互作用。具體方法包括原位的鄰位連接技術(shù)(insituPLA)，熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)技術(shù)以及免疫金電鏡技術(shù)。通過構(gòu)建多壁碳納米管與細(xì)胞膜受體相互作用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以及?duì)多壁碳納米管表面進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?，本研究證明上述三種方法可有效地用于研究納米材料與細(xì)胞膜受體的相互作用。這些實(shí)驗(yàn)方法將有助于研究納米材料生

7、物學(xué)效應(yīng)的分子機(jī)制以及表面修飾對(duì)納米材料生物學(xué)性質(zhì)的影響規(guī)律。
　　 本實(shí)驗(yàn)室及其他課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)，單壁和多碳納米管能抑制細(xì)胞的骨形成蛋白(bonemorphologyproteins，BMP)信號(hào)通路。BMP信號(hào)通路包括多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)步驟，我們對(duì)碳納米具體的作用機(jī)制還不甚明了。在本論文的第2章中，我們利用在第一章中開發(fā)的方法對(duì)多壁碳納米管與BMP信號(hào)通路相互作用的分子機(jī)制進(jìn)行了探索。研究結(jié)果表明，多壁碳納米管與2型BMP受

8、體結(jié)合，抑制其磷酸化1型BMP受體的激酶活性是導(dǎo)致BMP信號(hào)通路活性下調(diào)的原因。這一發(fā)現(xiàn)的意義在于，明確納米材料作用于細(xì)胞信號(hào)通路的機(jī)制之一是通過與細(xì)胞膜表面受體相互作用的方式，這種相互作用的本質(zhì)是納米材料與蛋白的相互作用。這一認(rèn)識(shí)對(duì)通過改造多壁碳納米管表面化學(xué)來調(diào)節(jié)其對(duì)細(xì)胞命運(yùn)（例如，干細(xì)胞分化）的影響具有理論上的指導(dǎo)作用。
　　 了解碳納米管自身的生物學(xué)活性是充分開發(fā)其生物醫(yī)學(xué)用途以及避免潛在毒性的前提。在真核細(xì)胞內(nèi)，BMP

9、信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)諸多重要細(xì)胞功能。本論文進(jìn)一步系統(tǒng)地研究了多壁碳納米管對(duì)BMP信號(hào)通路介導(dǎo)的一系列生物學(xué)事件，這些生物學(xué)事件包括干細(xì)胞的分化、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞增殖（細(xì)胞周期）。
　　 研究碳納米管對(duì)干細(xì)胞分化功能的影響不僅具有指導(dǎo)組織工程臨床應(yīng)用的價(jià)值，還具有重要的理論意義。這是因?yàn)?，一方面，研究發(fā)現(xiàn)碳納米管的機(jī)械力學(xué)以及電學(xué)性質(zhì)十分適合應(yīng)用于干細(xì)胞組織工程中，因此與干細(xì)胞相互作用直接影響其作為組織工程基質(zhì)的生物學(xué)表現(xiàn);另一方面

10、，許多調(diào)控干細(xì)胞分化及命運(yùn)的信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的生理過程中亦發(fā)揮重要的功能，例如，BMP信號(hào)通路調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞的多個(gè)分化方向，同時(shí)，它也在乳腺癌細(xì)胞中具有很高的活性。因此了解碳納米管對(duì)干細(xì)胞命運(yùn)的作用規(guī)律對(duì)其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的其他方面亦具有啟發(fā)作用?；谶@一認(rèn)識(shí)，在本論文的第3、4、5章中，我們研究了多壁碳納米管對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞系C2C12的成肌分化的影響。研究結(jié)果表明，對(duì)BMP信號(hào)通路的抑制作用增強(qiáng)了C2C12的成肌分化，而且，這種效應(yīng)受

11、多壁碳納米管表面化學(xué)修飾的調(diào)節(jié)。對(duì)成肌分化過程中分子事件的逐步分析結(jié)果顯示，多壁碳納米管抑制BMP信號(hào)通路，導(dǎo)致其靶標(biāo)蛋白——DNA結(jié)合抑制蛋白/分化抑制蛋白(Id)的表達(dá)水平下調(diào)，這減弱了其對(duì)成肌調(diào)節(jié)因子，一類具有堿性螺旋—環(huán)—螺旋(basichelix-loop-helix，bHLH)結(jié)構(gòu)的蛋白的負(fù)調(diào)控作用，因此加強(qiáng)成肌分化。由于多壁碳納米管通過抑制2型BMP受體來調(diào)節(jié)BMP信號(hào)的傳導(dǎo)過程，基于納米材料的表面性質(zhì)決定其與蛋白相互作用

12、的模式與強(qiáng)度這一認(rèn)識(shí)，我們假設(shè)改變多壁碳納米管的表面化學(xué)能調(diào)節(jié)其與膜蛋白相互作用的模式與強(qiáng)度，從而改變依賴受體功能的信號(hào)傳導(dǎo)。用本實(shí)驗(yàn)室先前報(bào)導(dǎo)的多壁碳納米管組合化學(xué)庫(kù)對(duì)成肌分化信號(hào)的篩選結(jié)果證實(shí)了這一假設(shè)，顯示了對(duì)納米材料生物學(xué)性質(zhì)人為調(diào)控的可能性。
　　 在本論文的第6、7章中，我們研究了多壁碳納米管抑制BMP信號(hào)通路所導(dǎo)致的另一生物學(xué)事件。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多壁碳納米管誘導(dǎo)的p21蛋白的高表達(dá)能抑制多種誘因?qū)е碌募?xì)胞凋亡，并且

13、是導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯的原因。p21蛋白既是一種細(xì)胞周期素依賴的激酶抑制劑，參與器官發(fā)育過程中及應(yīng)激條件下細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，又是一種細(xì)胞凋亡的抑制因子。本研究發(fā)現(xiàn)多壁碳納米管對(duì)BMP信號(hào)通路抑制的另一效應(yīng)是激活p53非依賴途徑的p21蛋白的高表達(dá)。p21蛋白從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中，在線粒體上與凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的前體蛋白Procaspase-3結(jié)合，抑制其水解活化成有活性的Caspase-3形式，從而抑制細(xì)胞的凋亡過程。另一方面

14、，p21蛋白與CyclinD/CDK4，6復(fù)合體結(jié)合，抑制該復(fù)合體對(duì)Retinoblastoma(Rb)蛋白的磷酸化作用，導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞周期的阻滯。
　　 細(xì)胞對(duì)納米材料的攝入機(jī)制是一項(xiàng)重要的研究課題。納米材料的物理因素，包括尺寸及形狀能影響這一過程。在本論文的最后一章中，我們研究了一種具有獨(dú)特形狀——二維盤狀的聚合物納米材料(Nanodisks)的細(xì)胞攝入規(guī)律及細(xì)胞毒性。研究發(fā)現(xiàn)，這種獨(dú)特的形狀大大增強(qiáng)了其與細(xì)胞膜的相互作用，阻礙