多壁碳納米管的免疫學效應研究.pdf

1、納米技術(shù)的進步正在對醫(yī)藥領域的發(fā)展發(fā)揮著越來越重要的作用,迄今為止,在納米生物醫(yī)學領域已經(jīng)有諸多納米材料被廣泛研究,以探索其在疾病早期診斷和有效治療方面的應用潛能。在眾多的納米材料中,碳納米管是最具吸引力的納米材料之一。碳納米管具有獨特的物理和化學特性,表面可以被化學修飾,并進一步與藥物、蛋白、基因等物質(zhì)相結(jié)合,用于疾病的診斷與治療。碳納米管作為一種外源性異物進入機體時,首先面對的是機體的免疫系統(tǒng),碳納米管的免疫學效應是決定其臨床應用安

2、全性的首要因素之一,人們對納米粒子與免疫系統(tǒng)作用的了解還處于初級階段,碳納米管的免疫效應與其分散狀態(tài)、使用形式、應用濃度等多種因素有關(guān),因此,對不同種類的碳納米管需要分別進行研究。
　　 本論文的研究工作主要包括以下方面:
　　 (1)基于實驗室以往建立的碳納米管表面處理技術(shù),利用超聲與混合濃酸相結(jié)合的氧化方法制備了在水溶液中能夠穩(wěn)定分散的多壁碳納米管(MWCNTs),采用掃描電鏡、動態(tài)光散射、表面能譜、紅外光譜等進行理

3、化性質(zhì)表征,并建立了水溶液中MWCNTs的定量方法。
　　 (2)研究了皮下注射MWCNTs在正常小鼠體內(nèi)引起的免疫響應及時間效應。利用病理學和免疫組化分析方法觀察了碳納米管的體內(nèi)分布及對組織器官的影響,應用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)和蛋白芯片技術(shù)研究了碳納米管對小鼠補體系統(tǒng)的活化和外周血中炎性細胞因子表達的影響,應用流式細胞分析技術(shù)研究了外周血中淋巴細胞亞群分布的變化,應用血液生化分析技術(shù)檢測了小鼠的肝、腎功能變化。

4、>　　 (3)研究了皮下注射MWCNTs所引起的免疫學效應對腫瘤免疫治療的潛在應用價值。在荷瘤小鼠模型上研究了MWCNTs對補體系統(tǒng)的活化和誘導的炎性細胞因子的表達,通過腫瘤生長曲線觀察了MWCNTs通過免疫刺激作用而產(chǎn)生的對腫瘤生長的抑制作用。
　　 (4)以牛血清白蛋白(BSA)作為模型分子,研究了MWCNTs對蛋白質(zhì)分子的作用。在研究MWCNTs對BSA吸附作用的同時,探討了MWCNTs對水溶液中未被吸附的BSA分子結(jié)構(gòu)

5、的影響,采用紅外圓二色譜(CD)檢測了BSA二級結(jié)構(gòu)組分的變化,用原子力顯微鏡(AFM)觀察了BSA空間結(jié)構(gòu)的改變,用等電聚焦電泳(IEF)分析了BSA等電點的變化,同時用電泳(SDS-PAGE)和質(zhì)譜(MOLD-TOF-MS)測定了BSA的分子量。
　　 (5)檢測了經(jīng)過不同條件處理的碳納米管樣品中內(nèi)毒素的水平,探討鱟試劑檢測內(nèi)毒素的方法對碳納米管的可適用性。
　　 取得的主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)注射的

6、MWCNTs大部分在皮下注射部位蓄積,并招募大量巨噬細胞對其進行吞噬；少部分吞噬了MWCNTs的巨噬細胞隨循環(huán)系統(tǒng)遷移到淋巴結(jié)內(nèi),三個月后仍可觀察到,但沒有引起明顯的炎癥反應；在心、肝、脾、腎等臟器中沒有觀察到MWCNTs的明顯蓄積,上述臟器表現(xiàn)的炎癥反應在注射1周后逐漸減弱,1個月后臟器組織回復到正常組織狀態(tài),未發(fā)現(xiàn)長期炎癥反應或肉芽腫的形成,主要臟器沒有發(fā)生明顯的病變。
　　 (2)皮下注射的MWCNTs會引起正常小鼠補體系

7、統(tǒng)的活化和炎性細胞因子表達的上調(diào):注射后2天,補體成分C3明顯降低,C5a水平顯著升高,40種炎性細胞因子中的絕大部分均有不同程度的明顯升高。上述效應具有明顯的時間依賴性,在注射1周后逐步回復到正常水平。
　　 (3)在荷瘤鼠模型上,皮下注射的MWCNTs起到了一定的免疫刺激作用,表現(xiàn)為:補體成分C3顯著降低、巨噬細胞大量吞噬碳納米管、炎性細胞因子的表達水平升高、MHCII表達升高和B淋巴細胞數(shù)量增加。結(jié)果表明,機體產(chǎn)生了針對腫

8、瘤的免疫反應。同時,從腫瘤生長曲線觀察到腫瘤的生長受到一定程度的抑制。
　　 (4)碳納米管對BSA有瞬間吸附和動態(tài)吸附的作用,同時對于溶液體系中未被吸附的蛋白,碳納米管對其結(jié)構(gòu)也有一定的影響:其二級結(jié)構(gòu)組成中β-折疊減少,β-轉(zhuǎn)角和α-螺旋增加,這導致了其空間構(gòu)型發(fā)生了變化,同時使其等電點向堿性端移動。
　　 (5)碳納米管的分散會對鱟試劑檢測過程產(chǎn)生干擾,分散效果好的碳納米管會使實驗結(jié)果出現(xiàn)假陽性,提示需要用多種方法