多壁碳納米管致大鼠肺損傷研究.pdf

1、碳納米管是現(xiàn)今全球消費(fèi)量最大的納米材料之一。因其具有強(qiáng)度高、吸收能力強(qiáng)、熱穩(wěn)定性好和電磁學(xué)性能優(yōu)異等多種特性,現(xiàn)已應(yīng)用在生物醫(yī)藥領(lǐng)域,可用于疾病診斷、輔助成像和藥物傳輸。碳納米管根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同分為:多壁碳納米管(multi-wall carbon nanotubes,MWCNTs)和單壁碳納米管(single-wall carbonnanotubes,SWCNTs)。碳納米管質(zhì)量輕,可在空氣中傳播,尤其可以在肺部沉積,已有的研究結(jié)果提示

2、物質(zhì)在納米尺度可能比在常規(guī)尺度下表現(xiàn)出更大的毒性。因此,碳納米管的呼吸毒性引起人們廣泛的關(guān)注。
　　 目前國(guó)內(nèi)外的研究多集中于SWCNTs的健康效應(yīng),對(duì)MWCNTs的研究較少。鑒于MWCNTs和SWCNTs理化性質(zhì)不同,可能導(dǎo)致機(jī)體健康效應(yīng)的差異。因此有必要對(duì)MWCNTs的環(huán)境和生物安全性進(jìn)行研究,為相關(guān)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù),為人群的健康防護(hù)奠定基礎(chǔ)。
　　 本課題以已知成份和粒徑大小的MWCNTs為研究對(duì)象,采用

3、體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞研究MWCNTS的細(xì)胞毒性和氧化損傷作用,并采用整體動(dòng)物氣管滴注染毒研究MWCNTS致肺損傷作用,及所致肺損傷的時(shí)間效應(yīng)。
　　 第一部分為體外實(shí)驗(yàn),研究MWCNTs對(duì)巨噬細(xì)胞和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性及氧化損傷作用。本次實(shí)驗(yàn)將小鼠巨噬細(xì)胞株(RAW264.7)和人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞暴露于2.5、10、25、100μg/ml的MWCNTs混懸液,染毒24h后,采用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率、用化學(xué)

4、測(cè)定法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的總蛋白(TP)、乳酸脫氫酶(LDH)和一氧化氮(NO)水平,并測(cè)定細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)、超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)等細(xì)胞毒性及氧化損傷指標(biāo)。用魯米諾誘導(dǎo)的化學(xué)發(fā)光法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平,并分別測(cè)定了染毒后RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力和A549細(xì)胞產(chǎn)生活性氧族的情況。
　　 RAW264.7細(xì)胞和A549細(xì)胞在染毒24h后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。隨著染毒濃度的上升,兩種細(xì)胞存活率下降,

5、并存在劑量依賴關(guān)系。在相同染毒濃度下,RAW264.7細(xì)胞的存活率比A549細(xì)胞高。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TP、LDH和NO的釋放水平隨著染毒濃度的增高而逐漸增加,各染毒組RAW264.7細(xì)胞和A549細(xì)胞內(nèi)的GSH、SOD含量呈降低趨勢(shì),MDA含量呈升高趨勢(shì),顯示出劑量依賴關(guān)系。在相同染毒濃度下,A549細(xì)胞表現(xiàn)出更嚴(yán)重的細(xì)胞毒性反應(yīng)和氧化損傷情況。此外,在誘導(dǎo)兩種細(xì)胞的氧自由基活性增加的同時(shí),MWCNTs不但能顯著降低巨噬細(xì)胞的吞噬功能,

6、其還能誘導(dǎo)A549細(xì)胞ROS水平升高,造成RAW264.7細(xì)胞和A549細(xì)胞抗氧化能力降低,引起氧化損傷,這可能是造成細(xì)胞損傷的重要途徑之一。
　　 第二部分為整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn),研究MWCNTs致肺損傷作用。將12周齡Wistar大鼠192只,雌雄各半,隨機(jī)分成6組,即生理鹽水對(duì)照組、DNA鈉鹽溶劑對(duì)照組、超細(xì)碳黑組、MWCNTs染毒組(2.0、10.0、20.0mg/ml)。采用氣管滴注法染毒,每天染毒一次,連續(xù)染毒3d。最后一次

7、染毒結(jié)束后24h、7d、28d和90d分四批處死大鼠,收集肺灌洗液,測(cè)定灌洗液中總蛋白(TP)、乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(AKP)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)等細(xì)胞毒性及氧化損傷指標(biāo),并觀察肺組織病理改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,灌洗液中TP、LDH、AKP和MDA含量隨著染毒濃度的增加而升高,并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低;灌洗液中GSH、SOD均有不同程度的降低程度,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)有不同程度的升高,呈劑量依

8、賴關(guān)系。肺組織病理學(xué)檢顯示各染毒組出現(xiàn)單核細(xì)胞浸潤(rùn)和淋巴細(xì)胞增生、黏膜損傷和血管出血等炎癥性病變,肺泡腔內(nèi)和肺泡間隔中可見黑色MWCNTs顆粒沉積,并且隨著劑量的增加病變程度有加重的趨勢(shì)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),各染毒組的病理改變有所緩解。與超細(xì)碳黑組相比,染毒量組在7d時(shí)肺出現(xiàn)了肉芽腫,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)于90d時(shí)發(fā)展為多中心性肉芽腫,此外,中、高劑量染毒組于90d時(shí)肺組織中出現(xiàn)膠原細(xì)胞沉積。電鏡下可見MWCNTs染毒組出現(xiàn)細(xì)胞核膜腫脹、環(huán)形線粒

9、體、以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等改變。另外,MWCNTs于28d開始出現(xiàn)肺門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,提示MWCNTs通過呼吸道途徑進(jìn)入體內(nèi)后,可經(jīng)肺淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到其他組織器官。總之,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MWCNTs可引起肺組織炎癥反應(yīng)和氧化損傷,對(duì)大鼠具有肺毒性作用。
　　 本次研究采用的MWCNTs(Nanocyl(R)3150)由日本名古屋工業(yè)大學(xué)提供,其粒徑為10nm,純度＞95％,碳含量＜5％,長(zhǎng)度＜1μm。用脫氧核苷酸鈉鹽(DNA鈉鹽)提高M(jìn)WCNT