CRISP2蛋白在弱精癥精液精子中表達下調(diào)的分子機制及其臨床意義.pdf

1、不孕不育已逐漸成為全球性的健康問題，影響著全球15％的育齡夫婦。這些不孕不育夫婦中男性因素占50％，而獲得性和先天性精子異常是男性不育的重要因素。作為精子質(zhì)量異常最常見的類型，弱精癥是引起男性不育主要的因素之一。
　　近年來許多研究已經(jīng)開始關(guān)注于弱精癥發(fā)生發(fā)展的分子機制。一些差異表達基因，諸如Tekt2，DNAI1，DNAH5，DNAHll，Akap4，Sept4和CRISP2(cysteine-rich secretory pr

2、otein2)，被認為與弱精癥密切相關(guān)。其中CRISP2，屬于CRISP/antigen5/pathogenesis(CAP)蛋白超家族中的CRISPs家族，因其特殊的定位和功能，引起了較為廣泛的關(guān)注和研究。CRISP2蛋白，作為CRISPs家族中激素非依賴性，且唯一特異性表達于睪丸的蛋白，定位于精子頂體和尾部的外致密纖維鞘。在功能上，CRISP2蛋白通過RyR(ryanodinereceptor)受體調(diào)控Ca2+離子通道的活性，參與精

3、子鞭毛運動的調(diào)節(jié)、頂體反應(yīng)和精卵融合等過程?；蛐酒瑪?shù)據(jù)提示CRISP2與精子的發(fā)生以及男性不育密切相關(guān)。有研究表明CRISP2在弱精癥精液精子中表達下調(diào)，并且動物牛中低水平的CRISP2與低的受孕率相關(guān)，以上數(shù)據(jù)均提示CRISP2參與弱精癥的發(fā)生發(fā)展。因此，CRISP2在弱精癥患者精液精子中表達下調(diào)的分子機制值得進一步探討。
　　基因的表達通常由遺傳和表觀遺傳學(xué)共同調(diào)控。DNA甲基化和micrRNAs(miRNA)調(diào)控作為表觀遺

4、傳學(xué)中兩項重要的調(diào)控機制，參與著許多生物學(xué)過程。目前研究表明異常的DNA甲基化與精子功能低下、少精密切相關(guān);miRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控參與精原細胞的誘導(dǎo)和分化，miRNA表達譜顯示miRNAs廣泛表達于哺乳動物的睪丸，鼠的生殖細胞以及人的精液精子中，提示miRNAs調(diào)控著精子發(fā)生的不同階段。然而，目前仍不清楚DNA甲基化和miRNA調(diào)控是否參與調(diào)控弱精癥CRISP2的低表達。
　　目的:在本研究中，我們將探討弱精癥精液精子中CRIS

5、P2的表達情況，CRISP2基因啟動子區(qū)域甲基化的狀態(tài)，以及microRNA27b(miR-27b)調(diào)控CRISP2低表達的機理，同時闡明miR-27b和CRISP2在弱精癥、男性不育的臨床意義。本研究將為弱精癥的發(fā)生機制提供新的理論依據(jù)。
　　方法和結(jié)果:1.弱精癥精液精子中CRISP2蛋白表達下調(diào)，而CRISP2基因mRNA表達無差異。
　　通過qRT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測48例弱精癥和42例正常精液

6、精子中CRISP2基因的mRNA和蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)弱精癥精液精子中CRISP2基因的mRNA表達水平和正常組比較無差異(P=0.3854，圖1-3)，但CRISP2蛋白卻表達下調(diào)（圖1-4）。
　　2.弱精癥精液精子CRISP2基因啟動子CpG島未發(fā)現(xiàn)甲基化
　　精液精子中包含著早期精子發(fā)生階段的表觀遺傳學(xué)信息，可以通過檢測精液精子中的甲基化狀態(tài)來評估精子發(fā)生階段的甲基化情況[40]。通過甲基化特異性PCR(methyla

7、tion-specific PCR，MSP)和硫化測序PCR(bisulfite-sequencingPCR，BSP)技術(shù)檢測48例弱精癥和42例正常精液精子中CRISP2基因啟動子CpG島甲基化狀態(tài)，均未發(fā)現(xiàn)其啟動子CpG島存在甲基化（圖2-2，2-3，2-4）。
　　3.MiR-27b在弱精癥精液精子中表達升高，并且miR-27b可以通過靶向結(jié)合CRISP2基因3'-UTR并調(diào)控其表達。
　　MiRNAs調(diào)控作為表觀遺傳

8、學(xué)的重要機制，可以通過與靶基因mRNA不完全互補配對而在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達進行負調(diào)控，導(dǎo)致mRNA的翻譯抑制或降解。據(jù)此，我們將探討miRNA調(diào)控在弱精癥中CRISP2表達的作用。運用生物信息學(xué)預(yù)測軟件miRWalk（包括miRDR，miRWalk和Targetscan數(shù)據(jù)庫）預(yù)測可能作用于CRISP2基因3’-UTR的miRNAs——miR-27a，miR-27b，miR-502-3p，miR-510，miR-640和miR-7

9、67-5p（圖3-3）。通過臨床精液樣本qRT-PCR技術(shù)初步篩選發(fā)現(xiàn)miR-27b在弱精癥精液精子中高表達(P=0.0071，圖3-4A)，隨后在更大臨床樣本中亦證實miR-27b在弱精癥精液精子中高表達(P=0.0013，圖3-5)，提示弱精癥中miR-27b和CRISP2密切相關(guān)。
　　為進一步探討miR-27b對CRISP2的靶向調(diào)控作用，我們構(gòu)建搭載CRISP2基因3'-UTR的pEZX-MT05熒光質(zhì)粒，然后通過293

10、T細胞體外共轉(zhuǎn)染pEZX-MT05質(zhì)粒和miR-27b mimic，檢測熒光信號強度。結(jié)果顯示miR-27b可以明顯抑制搭載CRISP2基因3'-UTR的pEZX-MT05質(zhì)粒的熒光強度，提示CRISP2是miR-27b的靶基因，miR-27b可能通過抑制CRISP2參與弱精癥的發(fā)生。
　　最后，對90位參與者進行為期1年的婚育史隨訪調(diào)查研究。將63位有效回訪者根據(jù)其miR-27b或CRISP2蛋白的表達水平分別分為miR-27b

11、相對高表達組和miR-27b相對低表達組，以及CRISP2蛋白相對高表達組和CRISP2蛋白相對低表達組。分別計算各組的不育率，采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗分析不同分組間不育率的差異（圖4-5）。弱精癥組的不育率明顯高于正常對照組(32％，P=0.0038，表4-3)，miR-27b相對高表達組的不育率明顯高于miR-27b相對低表達組(P=0.0376，表4-4)，CRISP2蛋白相對低表達組的不育率明顯高于CRISP2蛋白相對

12、高表達組(P=0.0335，表4-5)，提示低表達的CRISP2蛋白、高表達的miR-27b與不育密切相關(guān)。
　　在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-27b可能調(diào)控CRISP2基因的表達，并通過生物信息學(xué)預(yù)測、臨床樣本篩選、熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)、293T細胞體外轉(zhuǎn)染miRNAs、精液樣本中miR-27b和CRISP2相關(guān)性分析等一系列研究首次證實miR-27b可以通過直接靶向結(jié)合CRISP2基因3’-UTR并抑制其蛋白的表達。

13、r>　　MiR-27b，在許多腫瘤中被認為是一種腫瘤抑制因子，可以抑制炎癥反應(yīng)、血管生成以及介導(dǎo)脂肪生成障礙、線粒體損傷。miRNA芯片數(shù)據(jù)顯示miR-27b廣泛表達于睪丸、卵巢以及受精卵，并且高表達于弱精癥患者精液精子，提示在不同的精子發(fā)生過程中，miR-27b可能是一個重要的調(diào)節(jié)因子。研究報道，CRISP2廣泛表達并參與精子發(fā)生、睪丸后精子成熟等不同階段。許多研究顯示CRISP2參與睪丸中Sertoli支持細胞間的粘附，特異性表達于

14、睪丸，定位于精子的頂體和尾部，最終通過頂體反應(yīng)或與頂體赤道段的再關(guān)聯(lián)反應(yīng)參與受精過程。特別地，基于基因芯片數(shù)據(jù)的分析提示CRISP2的異常表達與精子發(fā)生阻滯、功能缺失相關(guān)。更為有趣的是，盡管目前普遍認為精子在翻譯水平是沉默的，但Yael Gur和H aim Breitbart證實哺乳動物精子在受精前發(fā)生了蛋白質(zhì)的表達[77-79]。這與我們觀察到的結(jié)果相一致——弱精癥精液精子中CRISP2基因mRNA表達水平無差異，而蛋白則表達下調(diào)。綜

15、上所述，CRISP2及其特異性調(diào)節(jié)因子miR-27b可能參與了精子發(fā)生、成熟、受精前等過程，盡管需要后續(xù)更多的研究數(shù)據(jù)支持。
　　弱精癥是指精子活力低下的病癥，臨床上常伴隨著精子密度低下和精子畸形率升高[3]。精子活力低下是導(dǎo)致男性不育的重要因素[80]，而精子的活力和自然受孕率又密切相關(guān)[81，82];文獻報道在動物牛精液精子中低表達的CRISP2將會引起低的受孕率[33]。因此，為探討miR-27b和CRISP2在弱精癥、男性

16、不育中的臨床意義，我們分析了miR-27b和CRISP2與精液基本參數(shù)的相關(guān)性，并對所有參與者進行了為期1年的婚育史隨訪調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)精液精子中高表達的miR-27b、低表達的CRISP2蛋白和低的前向運動精子率、形態(tài)正常精子率密切相關(guān)，隨訪研究結(jié)果亦顯示弱精癥組的不育率高于正常對照組，高表達的miR-27b、低表達的CRISP2蛋白和高的不育率密切相關(guān)。盡管可能存在更多的miR-27b靶基因參與弱精癥、男性不育的發(fā)生，但我們的研究揭示

17、了在精子發(fā)生到受精前，miR-27b可能通過抑制CRISP2蛋白的表達，影響精子的活力和形態(tài)，進而參與弱精癥、男性不育的發(fā)生發(fā)展。
　　本研究闡明了弱精癥精液精子中CRISP2蛋白表達下調(diào)的一種新機制，為男性不育的靶向性治療以及男性避孕的可能提供了理論基礎(chǔ)。
　　結(jié)論:1.弱精癥精液精子中CRISP2蛋白表達下降，而mRNA表達水平未見改變，提示CRISP2基因的表達可能不受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，并且低表達水平的CRISP2蛋白與

18、弱精癥關(guān)系更密切。
　　2.弱精癥和正常精液精子中均未發(fā)現(xiàn)CRISP2基因啟動子CpG島存在甲基化，提示DNA甲基化不參與弱精癥中CRISP2表達的調(diào)控，CRISP2蛋白表達下調(diào)可能受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制影響。
　　3.miR-27b在弱精癥精液精子中高表達，并且可以通過直接靶向結(jié)合CRISP2基因3'-UTR并抑制其蛋白的表達。
　　4.miR-27b可能通過靶向結(jié)合CRISP2基因3'-UTR并抑制其蛋白的表達，影響精子