組織因子及其剪切體在胃癌組織中表達(dá)的臨床意義及作用機(jī)制研究.pdf

1、組織因子（tissue factor，TF)是一種分子量為47kDa的膜性糖蛋白，不僅作為凝血激活因子，在多種生物學(xué)過程尤其在腫瘤生長與轉(zhuǎn)移中具有重要意義。TF表達(dá)為兩種自然發(fā)生的蛋白亞型，膜結(jié)合的全長 TF（flTF）和選擇性剪切亞型組織因子（asTF）。實(shí)驗(yàn)和臨床證據(jù)均表明，在腫瘤中有異常的 TF表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤生長與轉(zhuǎn)移。TF及其剪切亞型（剪切體）的表達(dá)和功能的調(diào)節(jié)受多種因素影響。腫瘤相關(guān)刺激信號(hào)可調(diào)節(jié) TF的表達(dá)。作為 TF轉(zhuǎn)錄

2、后調(diào)節(jié)機(jī)制，microRNA直接或間接控制TF的表達(dá)和功能。胃癌是最常見的惡性腫瘤之一。目前證實(shí)胃癌中有TF表達(dá)異常，并且其表達(dá)水平與腫瘤的多種生物學(xué)行為有關(guān)。但asTF在胃癌中的臨床意義及調(diào)節(jié)機(jī)制尚不完全明了。本實(shí)驗(yàn)通過自行設(shè)計(jì)asTF的引物和探針應(yīng)用qRT-PCR方法檢測人胃癌組織中flTF、asTF mRNA的表達(dá)水平并分析與臨床病理的相關(guān)性，應(yīng)用Cox模型探討其在患者生存時(shí)間等預(yù)后因素中的價(jià)值。體外研究了促炎因子 TNF-α刺激

3、胃癌 MKN28細(xì)胞后 flTF、asTF mRNA表達(dá)水平的變化。由于長鏈非編碼 RNA（lncRNAs）可以作為一種競爭性內(nèi)源性RNA（ceRNA）與miRNA相互作用，參與靶基因的表達(dá)調(diào)控，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。我們通過構(gòu)建慢病毒pLVX-H19 lncRNA-shRNA下調(diào)載體系統(tǒng)，TF過表達(dá)載體，qRT-PCR法檢測基因表達(dá)水平，WesternBlot檢測TF蛋白表達(dá)水平，CCK8法測定細(xì)胞生長活力，Transw

4、ell檢測細(xì)胞侵襲能力，探討lncRNA H19與miRNA19a(miR-19a)相互作用通路在胃癌細(xì)胞中對flTF、asTF基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，為TF的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)途徑的靶向治療提供理論依據(jù)。
　　本課題結(jié)果提示：（1）meta分析結(jié)果表明，TF陽性表達(dá)與腫瘤區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在一定的相關(guān)性(P=0.001)，單變量與多變量相關(guān)生存分析 TF陽性表達(dá)與腫瘤生存、預(yù)后之間均存在明顯的相關(guān)性(P值均<0.0001)；我們未發(fā)現(xiàn)TF

5、陽性表達(dá)與腫瘤瘤體大小、生長之間有相關(guān)性；關(guān)于asTF在腫瘤中表達(dá)及臨床意義的研究報(bào)道較少，檢索到的文獻(xiàn)原始數(shù)據(jù)不足，無法完成meta分析。（2）本研究通過自行設(shè)計(jì)的檢測asTF的引物和TaqMan探針將上游引物設(shè)計(jì)在第四、第六外顯子的連接處，達(dá)到了避免同時(shí)擴(kuò)增出flTF基因片段的目的，可高效、準(zhǔn)確地檢測flTF及asTF的基因表達(dá)。（3）胃癌組織中flTF mRNA相對定量[7.45(0.34~33.68)]顯著高于正常胃組織[3.0

6、0(1.36~5.02)]，胃癌組織中asTF mRNA相對定量[0.88(0.07~26.00)]顯著高于正常胃組織[0.33(0.03~0.97)]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。flTF與 asTF基因表達(dá)水平與性別、年齡、TNM分期、腫瘤大小、組織學(xué)分型和化療敏感性等相關(guān)因素的關(guān)系差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Log-rank生存分析顯示 flTF mRNA低表達(dá)組[33.83(25.24~42.43)]比高表達(dá)組[

7、18.18(13.32~23.04)]平均術(shù)后生存時(shí)間顯著延長15.66個(gè)月(χ2=6.185，P=0.013)。asTF mRNA低表達(dá)組[25.32(21.19~29.45)]比高表達(dá)組[20.50(12.51~28.48)]平均術(shù)后生存時(shí)間顯著延長4.82個(gè)月(χ2=4.604，P=0.032)。flTF mRNA與asTF mRNA都是低表達(dá)組與flTF mRNA或asTF mRNA有一組高表達(dá)組比較，平均生存時(shí)間(月)及95％

8、CI分別為28.96(24.90～33.00)、23.40(16.27～30.51)，患者術(shù)后平均生存時(shí)間顯著延長5.56個(gè)月(χ2=4.548，P=0.033）。flTF mRNA與asTF mRNA同時(shí)低表達(dá)組與flTF mRNA與asTF mRNA同時(shí)高表達(dá)組比較，平均生存時(shí)間(月)及95%CI分別為31.07(23.21～38.92)、11.13(6.90～15.36)，患者術(shù)后平均生存時(shí)間顯著延長19.94個(gè)月(χ2=13.0

9、05，P=0.000)。flTF mRNA與asTF mRNA有一組高表達(dá)組較同時(shí)高表達(dá)組胃癌患者平均生存時(shí)間顯著延長16.92個(gè)月(χ2=6.346，P=0.012)。多因素 Cox模型分析顯示，flTF及 asTF均是胃癌獨(dú)立的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因素(HR=6.03，95%CI=1.02~35.71，P<0.05)及(HR=10.74，95%CI=2.32~49.59，P<0.01)。（4）體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TNF-α刺激下胃癌MKN28細(xì)胞的ln

10、cRNA H19和 flTF及asTF mRNA表達(dá)水平增高而miR-19a表達(dá)水平降低。miR-19a可與TF3’UTR結(jié)合抑制其表達(dá)，miR-19a可抑制胃癌細(xì)胞的TF蛋白水平的表達(dá)，flTF/asTF可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，而miR-19a可抑制其促增殖和侵襲作用。下調(diào)lncRNA H19可促進(jìn)miR-19a表達(dá)水平增高，降低asTF/flTF表達(dá)水平，抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。
　　綜上所述，我們自行設(shè)計(jì)的as

11、TF引物和TaqMan探針可較準(zhǔn)確地檢測asTF的基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)asTF mRNA的表達(dá)與flTF mRNA一樣，在胃癌組織中高表達(dá)，且與臨床病理無相關(guān)性，但與預(yù)后密切相關(guān)，其表達(dá)水平與胃癌患者術(shù)后生存時(shí)間負(fù)相關(guān)，聯(lián)合flTF的基因表達(dá)水平預(yù)測患者生存時(shí)間更有意義。證實(shí)TNF-α可體外促進(jìn)胃癌MKN28細(xì)胞TF表達(dá)增加，且受lncRNA H19與miR-19a通路的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，參與促進(jìn)胃癌的發(fā)生與發(fā)展。asTF與flTF以及l(fā)ncR