腎衰營養(yǎng)膠囊通過Wnt7A-Akt-mTOR、凋亡及自噬信號對骨骼肌細胞損傷的改善作用.pdf

1、慢性腎衰竭（Chronic renal failure，CRF）的并發(fā)癥之一進行性營養(yǎng)不良是許多患者面臨的難題，表現(xiàn)為血白蛋白減少、貧血、骨骼肌萎縮、機體蛋白質(zhì)儲備下降等。我國約有20％～50％的CRF患者發(fā)生營養(yǎng)不良。營養(yǎng)不良與患者的預(yù)后不良密切相關(guān)，可導(dǎo)致免疫功能低下、繼發(fā)感染、貧血、心血管事件發(fā)生率增加、甚至多臟器衰竭，使死亡率上升。據(jù)統(tǒng)計CRF患者中9.6％的死亡事件與嚴重營養(yǎng)不良有關(guān)，因此營養(yǎng)不良CRF的重要危險因素。CRF營

2、養(yǎng)不良病因眾多，發(fā)病機制復(fù)雜，蛋白質(zhì)攝入減少，酸中毒、內(nèi)分泌代謝異常，透析丟失蛋白質(zhì)，炎癥等多種原因均可導(dǎo)致營養(yǎng)不良。目前臨床治療主要使用復(fù)方α-酮酸（開同）等治療CRF營養(yǎng)不良，但其價格較昂貴，在臨床應(yīng)用中有局限。因此，如何經(jīng)濟有效地預(yù)防、治療CRF營養(yǎng)不良，是腎臟病領(lǐng)域亟需解決的問題。
　　CRF并發(fā)的營養(yǎng)不良是一種由蛋白質(zhì)過度消耗導(dǎo)致的營養(yǎng)失衡狀態(tài)，蛋白質(zhì)代謝與疾病的進展密切相關(guān)。骨骼肌組織蛋白質(zhì)儲量豐富，是蛋白質(zhì)代謝的主要

3、場所，骨骼肌的營養(yǎng)狀況可以直接反應(yīng)蛋白質(zhì)的代謝變化。在CRF狀態(tài)下，由于蛋白質(zhì)代謝失衡引起骨骼肌蛋白質(zhì)水平下降，并直接導(dǎo)致體重降低。體重下降是CRF營養(yǎng)不良最重要的診斷指標和臨床表現(xiàn)，而骨骼肌萎縮是重要的病理結(jié)果和評估指標。蛋白質(zhì)的代謝失衡包括了蛋白質(zhì)合成代謝減少和分解代謝增加，在CRF營養(yǎng)不良中起主導(dǎo)作用。在分子生物學(xué)方面，許多信號通路都參與對骨骼肌萎縮及肥大的調(diào)控。代謝性酸中毒、尿毒癥毒素、微炎癥狀態(tài)等可嚴重抑制蛋白質(zhì)合成代謝途徑，

4、蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白酶(Akt/mTOR)信號通路明顯下調(diào)。
　　除了蛋白質(zhì)的代謝失衡的原因，骨骼肌萎縮的過程中存在骨骼肌再生修復(fù)機制受損。骨骼肌衛(wèi)星細胞(skeleton satellite cell，MSC)的激活、增殖與分化對肌肉的再生起了決定性的作用。在CRF營養(yǎng)不良的環(huán)境下，毒素蓄積、酸中毒、內(nèi)分泌失常、營養(yǎng)元素缺乏、全身炎癥狀態(tài)、機體內(nèi)環(huán)境紊亂等能抑制MSC的激活、生長、分化過程。而長期營養(yǎng)不良MSC死亡后無再生

5、替代。根據(jù)這一變化，許多學(xué)者認為MSC數(shù)量減少甚至完全耗竭是造成CRF營養(yǎng)不良肌肉不斷萎縮的重要原因。肌肉組織中，Wnt7a可以提高MSC的數(shù)量，修復(fù)骨骼肌損傷，加速骨骼肌的生長。經(jīng)由Wnt7a的受體Fzd7，激活下游的AKT/mTOR信號通路，促進肌管肥大和肌纖維增加。
　　另外，骨骼肌的消耗的機制之一是肌細胞核數(shù)量的減少，這主要是通過細胞凋亡途徑丟失的。在骨骼肌消耗的狀態(tài)下，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達下調(diào)，促凋亡蛋白Bax、c

6、aspases的表達增加，說明在分解代謝狀態(tài)下，線粒體途經(jīng)的凋亡發(fā)揮著重要作用。自噬的發(fā)生與骨骼肌細胞損傷也有密切的關(guān)系，是真核細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和內(nèi)部生物大分子物質(zhì)的過程。目前認為絕大多數(shù)長半衰期蛋白質(zhì)的降解有細胞的自噬的參與。自噬的活化可導(dǎo)致蛋白分解和肌肉萎縮。雖然大量研究表明細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成代謝途徑Wnt7a-Akt/mTOR信號通路受損、肌細胞凋亡及自噬增加是導(dǎo)致骨骼肌萎縮的重要原因，但它們在CRF骨骼萎縮中的作

7、用及機制尚缺乏研究。
　　CRF營養(yǎng)不良導(dǎo)致的骨骼肌萎縮，屬于中醫(yī)的“虛勞”、“痿癥”等的范疇。CRF的病機為本虛標實，虛實夾雜。本虛即脾腎虛衰，標實為痰飲水濕濁毒。CRF時，患者的脾胃功能虛弱，水谷精微化氣行血受阻，臟腑形質(zhì)失養(yǎng)，功能失職，從而產(chǎn)生痰飲、水濕、濁毒等。因此，CRF營養(yǎng)不良病位在腎，關(guān)鍵在于脾。在CRF營養(yǎng)不良的全過程中脾胃功能失調(diào)貫徹始終。故治療上，當(dāng)攻補兼施，正邪兼顧，治以補脾益腎、滋養(yǎng)氣血、泄?jié)衽艥幔稣涣?/p>

8、邪，祛邪不傷正。腎衰營養(yǎng)膠囊是魏教授據(jù)多年臨床經(jīng)驗在“人參養(yǎng)榮湯”基礎(chǔ)上篩選藥物組方精制而成，在臨床上應(yīng)用多年，具有益腎健脾、補氣活血、通腑瀉濁的功效，是有確定療效的預(yù)防和治療CRF營養(yǎng)不良的藥物。臨床觀察表明，該方可以使患者的生活質(zhì)量有所改善，增加患者的食欲，增加體重，改善貧血，提高血漿白蛋白水平，但其作用的分子作用機制尚不明確，有待進一步研究。
　　本課題通過觀察腎衰營養(yǎng)膠囊對腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導(dǎo)形成的小鼠C2C

9、12骨骼肌細胞萎縮模型的影響，檢測小鼠C2C12骨骼肌Wnt7a-Akt/mTOR信號通路、肌細胞凋亡及自噬信號通路的表達，初步探討腎衰營養(yǎng)膠囊促進骨骼肌蛋白質(zhì)合成、MSC修復(fù)，拮抗MSC損傷，從而預(yù)防和改善骨骼肌萎縮及其相關(guān)的分子機制，為腎衰營養(yǎng)膠囊防治CRF營養(yǎng)不良，提供實驗依據(jù)。具體如下:
　　第一部分腎衰營養(yǎng)膠囊對C2C12肌管Wnt7a-Akt/mTOR信號通路的影響
　　目的:觀察腎衰營養(yǎng)膠囊對TNF-α誘導(dǎo)C2

10、C12骨骼肌肌管萎縮的改善作用，并探索改善骨骼肌萎縮、蛋白質(zhì)合成的相關(guān)分子機制。
　　方法:首先10％胎牛血清培養(yǎng)C2C12成肌細胞，再用2％馬血清分化培養(yǎng)基使C2C12成肌細胞分化成肌管。將培養(yǎng)的C2C12肌管分成4組，1組為正常血清組，其他3組用含有20 ng/mL TNF-α的培養(yǎng)基干預(yù)C2C12骨骼肌肌管，制造骨骼肌萎縮的模型，其中分別兩組添加腎衰營養(yǎng)膠囊含藥血清和開同含藥血清。4組分別為:正常血清組，TNF-α模型對照組

11、，TNF-α+10％腎衰營養(yǎng)膠囊含藥血清組，TNF-α+10％開同含藥血清組。每組均孵育24h之后進行細胞固定、染色，采用伊紅-蘇木素(HE)染色法。各組在200倍光鏡下拍照，各組肌管的平均橫徑用Image Pro-Plus軟件計算;采用Western blot法檢測各組Wnt7a、frizzled-7、p-Akt、p-mTOR的表達含量。采用GAPDH作為內(nèi)參照。
　　結(jié)果:與正常對照組相比，TNF-α模型組的肌管橫徑明顯減小，

12、腎衰營養(yǎng)膠囊及開同可以改善橫徑減小的程度，組間的比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而腎衰營養(yǎng)膠囊組與開同組之間肌管橫徑比較無差異;Wnt7a、frizzled-7、p-Akt、p-rmTOR在正常組中均有明顯或零散表達，TNF-α模型組中p-Akt、p-mTOR、Wnt7a、frizzled-7的表達量明顯減少，而腎衰營養(yǎng)膠囊及開同能夠恢復(fù)模型組信號因子的異常表達，組間的比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而腎衰營養(yǎng)膠囊及開同組之間相

13、比，p-Akt、p-mTOR、Wnt7a、frizzled-7的表達量均無差異。
　　結(jié)論:TNF-α可使骨骼肌萎縮，肌管橫徑減小，抑制Wnt7a-Akt/mTOR信號通路。腎衰營養(yǎng)膠囊可恢復(fù)Wnt7a-Akt/mTOR信號通路水平，使肌管橫徑增大，從而改善骨骼肌萎縮的狀態(tài)。
　　第二部分腎衰營養(yǎng)膠囊對C2C12成肌細胞Bcl-2/Bax凋亡途徑的影響
　　目的:觀察腎衰營養(yǎng)膠囊對TNF-α誘導(dǎo)的C2C12成肌細胞凋亡

14、的改善作用，并探索凋亡相關(guān)的分子機制。
　　方法:將培養(yǎng)的C2C12成肌細胞分成4組，1組為正常血清組，其他3組用含20 ng/mL TNF-α的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并分為:TNF-α模型對照組，TNF-α+10％腎衰營養(yǎng)膠囊含藥血清組，TNF-α+10％開同含藥血清組。孵育24h后用Hoechst33342染色法檢測各組C2C12成肌細胞凋亡狀況;用Western blot法對各組Cleaved caspase3、B淋巴細胞瘤-2基因相

15、關(guān)蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)表達量進行檢測。
　　結(jié)果:與正常對照組相比，TNF-α模型對照組C2C12成肌細胞的凋亡率明顯上升，與TNF-α模型對照組相比，經(jīng)腎衰營養(yǎng)膠囊及開同干預(yù)后能顯著減少凋亡，以上比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與正常對照組相比，在TNF-α模型組中，Cleaved caspase3、Bax表達顯著增加，Bcl-2表達減少。相對于模型組，腎衰營養(yǎng)膠囊及開同能夠顯著下調(diào)Cleave

16、d caspase3、Bax表達，恢復(fù)Bcl-2表達量，以上比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:腎衰營養(yǎng)膠囊對TNF-α誘導(dǎo)的C2C12成肌細胞凋亡具有改善作用，其機制可能是能通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax凋亡途徑實現(xiàn)的。
　　第三部分腎衰營養(yǎng)膠囊對C2C12成肌細胞自噬的影響
　　目的:觀察腎衰營養(yǎng)膠囊對TNF-α誘導(dǎo)的C2C12成肌細胞自噬的抑制作用，并探索自噬相關(guān)的分子機制。
　　方法:將培養(yǎng)的C2

17、C12成肌細胞分成4組，1組為正常血清組，其他3組用含20 ng/mL TNF-α的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并分:TNF-α模型對照組，TNF-α+10％腎衰營養(yǎng)膠囊含藥血清組，TNF-α+10％開同含藥血清組。孵育24h后用投射電鏡檢測各組C2C12成肌細胞自噬狀況;用Western blot法對各組LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ、beclin-1表達量進行檢測。
　　結(jié)果:與正常對照組相比，TNF-α模型對照組C2C12成肌細胞的自噬率明顯上

18、升，與TNF-α模型對照組相比，經(jīng)腎衰營養(yǎng)膠囊及開同干預(yù)后能顯著減少自噬，以上比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與正常對照組相比，在TNF-α模型組中，LC3B-Ⅱ/Ⅰ、beclin-1表達顯著增加，相對于模型組，腎衰營養(yǎng)膠囊及開同能夠顯著下調(diào)LC3B-Ⅱ/Ⅰ、beclin-1表達，以上比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:腎衰營養(yǎng)膠囊對TNF-α誘導(dǎo)的C2C12成肌細胞自噬具有抑制作用，其機制可能是能通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)