日本血吸蟲高遷移率族蛋白活化小鼠巨噬細胞和樹突狀細胞的功能研究.pdf

1、血吸蟲病廣泛流行于非洲、亞洲和南美，是僅次于瘧疾的一種寄生蟲病。血吸蟲病的長期防控依賴于高效疫苗的應(yīng)用。目前國際上公認的具有較高保護力效果的疫苗是輻照致弱的尾蚴/童蟲疫苗(RAV)，但由于材料來源困難、安全性等問題，不能大規(guī)模使用。因此，需要通過研究RAV模型的高保護性效應(yīng)機制來研發(fā)出高效、安全的抗血吸蟲分子疫苗。
　　研究發(fā)現(xiàn)RAV模型可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生高水平的以Th1為優(yōu)勢應(yīng)答的高保護力，其原因可能是輻照后蟲體損傷嚴重，移行緩慢，

2、長期滯留在肺部并伴隨大量蟲源性分子的釋放，引起宿主較強的免疫反應(yīng)。高遷移率族蛋白(HMGB1)是一種核蛋白，在電離輻射條件下可從核內(nèi)遷移至胞外。已有研究表明曼氏血吸蟲HMGB1可誘導(dǎo)宿主巨噬細胞釋放大量的致炎細胞因子，是引發(fā)宿主炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子。因此推測日本血吸蟲HMGB1(SjHMGB1)作為蟲源性的應(yīng)激分子在RAV誘導(dǎo)的高保護力中發(fā)揮了類似的重要作用。本研究旨在探索SjHMGB1在活化宿主免疫細胞，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)上的功能。為進一步闡

3、明SjHMGB1在RAV中發(fā)揮的作用奠定基礎(chǔ)。
　　1、分析SjHMGB1在輻照與正常蟲體細胞上的表達情況。體外培養(yǎng)不同期別的輻照和正常童蟲，用胰酶消化成單個細胞。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示SjHMGB1在輻照早期4d時的表達量明顯高于正常組，7d時顯著下降低于正常組(P＜0.01)，10d、14d兩者無顯著差異;RT-PCR檢測SjHMGB1的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)輻照組在4d、7d顯著高于正常組(P＜0.01)，在10d時兩組無顯

4、著差異。初步推斷SjHMGB1在輻照童蟲早期大量表達釋放。
　　2、分析reSjHMGB1誘導(dǎo)致敏小鼠淋巴細胞的反應(yīng)。reSjHMGB1蛋白刺激致敏小鼠淋巴細胞48h后，MTT法檢測淋巴細胞增殖、流式細胞術(shù)檢測淋巴細胞亞群狀況以及胞內(nèi)細胞因子的表達情況。結(jié)果顯示該蛋白能夠顯著的刺激致敏小鼠淋巴細胞增殖(SI＞2);蛋白免疫組CD4+/CD8+T細胞的比值為2.28顯著高于對照組的1.76(P＜0.01)，且胞內(nèi)IFN-γ的表達量顯

5、著增加(P＜0.01)。提示SjHMGB1蛋白可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答。
　　3、分析reSjHMGB1在調(diào)節(jié)宿主固有免疫中的作用。reSjHMGB1與RAW264.7細胞共孵育48h，通過流式細胞術(shù)檢測細胞表面分子、ELISA檢測胞外細胞因子。結(jié)果表明reSjHMGB1刺激組與對照組相比，RAW264.7細胞表面Toll受體4(TLR4)受體上調(diào)表達，差異極顯著(P＜0.01)，而Toll受體2(TLR2)受體下調(diào)表達(P

6、＜0.05)，同時胞外TNF-α和NO的分泌量顯著增加(P＜0.01)。提示SjHMGB1可通過TLR4通路誘導(dǎo)巨噬細胞向致炎性的M1型巨噬細胞分化。
　　4、研究reSjHMGB1誘導(dǎo)宿主樹突狀細胞(DC)功能成熟。reSjHMGB1刺激分選后的DC48h后再與CD4+T細胞共孵育168h，流式細胞術(shù)檢測DC表面分子、胞內(nèi)細胞因子和T細胞增殖情況，ELISA檢測胞外細胞因子分泌情況。結(jié)果表明reSjHMGB1刺激組DC細胞表面的

7、趨化因子受體CCR7和CXCR4顯著上調(diào)表達(P＜0.01)，同時胞外TNF-α，IFN-γ，IL-4的含量顯著增加(P＜0.01)。reSjHMGB1蛋白與DC和CD4+T共孵育實驗結(jié)果表明，CD4+T釋放IFN-γ顯著增加(P＜0.01)。提示SjHMGB1促進DC功能成熟，活化CD4+T細胞，誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答。
　　5、初步探索reSjHMGB1活化嗜中性粒細胞的功能。蛋白刺激嗜中性粒細胞4h后，通過顯微鏡觀察嗜中性粒細

8、胞胞外陷阱(NETs)的形成，RT-PCR檢測細胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。實驗結(jié)果表明蛋白刺激后可觀察到明顯的NETs現(xiàn)象，且與對照組相比MMP-9，MCP-1，CCL-3和CXCL-2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著提高(P＜0.01)。提示SjHMGB1能夠刺激嗜中性粒細胞向炎癥表型分化。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SjHMGB1在輻照童蟲早期大量表達及釋放，能夠活化巨噬細胞、促進DC功能成熟、活化CD4+T細胞并誘導(dǎo)其向Th1型分化。初