microRNA-449b對(duì)膿毒癥小鼠高遷移率族蛋白B1介導(dǎo)樹突狀細(xì)胞免疫功能障礙的影響.pdf

1、目的：探討miR-449b在高遷移率族蛋白B1（high mobility group box-1 protein, HMGB1）調(diào)控樹突狀細(xì)胞（dendritic cell, DC）免疫效應(yīng)中的作用及其對(duì)膿毒癥小鼠免疫功能障礙的影響。
　　方法：1 HMGB1分別以10、100、1000 ng/ml劑量刺激正常小鼠脾臟來源的CD11c+ DC，并分別于24 h、48 h及72 h檢測(cè)DC表面標(biāo)志物及共刺激分子（CD80、CD86

2、、MHC-II）、細(xì)胞因子分泌（IL-12、IL-10）以及 DC凋亡的改變；并用 QPCR檢測(cè)12 h、24 h、48 h細(xì)胞內(nèi) miR-449b改變。2 DC轉(zhuǎn)染 miR-449b模擬物（ miR-449b）、抑制物（ In-miR-449b）及相應(yīng)對(duì)照（miR-NC、In-miR-NC）后，HMGB1（100 ng/ml）刺激48 h收取細(xì)胞，檢測(cè) DC表面分子、細(xì)胞因子（IL-12、IL-10）、凋亡改變以及與T細(xì)胞混合培養(yǎng)后T

3、細(xì)胞增殖、分化功能的變化；進(jìn)一步應(yīng)用miRNA相關(guān)預(yù)測(cè)軟件及結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)確定 miR-449b介導(dǎo)這一過程中的潛在靶蛋白 Notch1和Sirt1，并用 western blot研究 miR-449b對(duì)靶蛋白的影響。3復(fù)制小鼠 CLP模型，術(shù)后48h及120h分別通過尾靜脈注射 miR-449b antagomir及對(duì)照（8mg/kg，300ul），觀測(cè)膿毒癥小鼠10天生存率。此外于術(shù)后第7天通過腹腔注射 LPS（10ug/只）給予二次

4、打擊，在6h后檢測(cè)各組小鼠血清中 IL-12及IL-10水平、脾臟中成熟DC所占比例以及脾臟DC表面分子表達(dá)、凋亡率及其對(duì) CD4+T細(xì)胞增殖分化的影響。
　　結(jié)果：1 HMGB1刺激 DC后，其表面分子及細(xì)胞因子IL-12隨著時(shí)間及劑量的增加表達(dá)上調(diào)，其中以48 h、100 ng/ml組上調(diào)最為明顯，而大劑量（1000 ng/ml）時(shí)及72 h組表達(dá)有所下調(diào)；隨著HMGB1劑量及刺激時(shí)間的增加，DC凋亡率升高，細(xì)胞因子 IL-1

5、0分泌增加（P<0.05）；miR-449b在12 h及24 h組表達(dá)下調(diào)，100及1000 ng/ml組在48 h表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05）。2轉(zhuǎn)染 miR-449b可上調(diào)其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而抑制物可抑制其表達(dá)；上調(diào)miR-449b后HMGB1（100 ng/ml）刺激48 h DC表面分子CD86表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05）、凋亡增加（P<0.01）、細(xì)胞因子 IL-10分泌增多（P<0.05），對(duì) T細(xì)胞的共刺激增殖效應(yīng)減弱及混合

6、性淋巴細(xì)胞反應(yīng)中 IL-4水平增多（P<0.01）、IFN-γ水平下降（P<0.05）；miR-449b的過表達(dá)可抑制靶蛋白Notch1及Sirt1的表達(dá)。3抑制miR-449b能明顯改善晚期膿毒癥小鼠的病死率，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)抑制 miR-449b的表達(dá)能明顯增加晚期膿毒癥小鼠血清中 IL-12的水平（P<0.05）、樹突狀細(xì)胞在脾臟中的比例（P<0.01）和表面分子 MHC-II（P<0.05）、CD80（P<0.05）的表達(dá)以及減少

7、凋亡（P<0.05）和血清中IL-10的水平（P<0.05），促進(jìn)T細(xì)胞的增殖(P<0.05)及向功能性Th1極化；miR-449b antagomir組靶蛋白Notch1及Sirt1有所上調(diào)。
　　結(jié)論：HMGB1介導(dǎo)小鼠脾臟DC成熟分化過程中miR-449b起重要的負(fù)性調(diào)控作用，并明顯促進(jìn)HMGB1刺激誘導(dǎo)的 DC凋亡；抑制 miR-449b表達(dá)水平可有效改善膿毒癥小鼠病死率及脾臟 DC的免疫功能狀態(tài)，可能是緩解機(jī)體免疫功能障