大鼠鼻黏膜外胚間充質(zhì)干細(xì)胞的干細(xì)胞特性研究及其在治療脊髓損傷中的應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　外胚間充質(zhì)干細(xì)胞(Ecto-mesenchymal stem cells，EMSCs)是間充質(zhì)干細(xì)胞的特殊類型，起源于胚胎時期的神經(jīng)嵴(Neural crest)，具有自我更新和多向分化潛能。本研究旨在探討大鼠鼻黏膜來源的EMSCs的干細(xì)胞特性和多向分化潛能，并探討其在纖維蛋白(Fibrin)支架上的多向分化潛能，為組織工程干細(xì)胞/支架移植尋找新的種子細(xì)胞。最后，將EMSCs/Fibrin支架移植到大鼠脊髓損傷（spi

2、nal cord injury, SCI）模型，評價其對脊髓損傷的修復(fù)效果。
　　方法:
　　1.制作大鼠鼻黏膜冰凍切片，用EMSCs標(biāo)志蛋白Nestin，CD133，CD44進(jìn)行免疫熒光染色，觀察其在大鼠鼻黏膜的分布特征。
　　2.用差速貼壁法純化EMSCs，并用成球?qū)嶒灱案鞣N干細(xì)胞標(biāo)志蛋白評價其干細(xì)胞特性。
　　3.用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)EMSCs向成骨細(xì)胞分化。用堿性磷酸酶染色檢測堿性磷酸酶活性;茜素紅染色檢

3、測誘導(dǎo)后細(xì)胞表面鈣結(jié)節(jié)來評價成骨誘導(dǎo)效果;用免疫熒光和蛋白免疫印跡檢測Collagen-Ⅰ、Osteocalcin、Osteopuntin及Runx2的表達(dá)水平評價EMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的效果。
　　4.用神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)EMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化。用神經(jīng)標(biāo)志蛋白Synapsin，Synaptotagmin，GAP43及NF-200進(jìn)行免疫熒光和蛋白免疫印跡，評價EMSCs向神經(jīng)細(xì)胞的分化效果。
　　5.用雪旺細(xì)胞誘導(dǎo)

4、培養(yǎng)基誘導(dǎo)EMSCs向雪旺細(xì)胞分化。用雪旺細(xì)胞標(biāo)志蛋白GFAP，p75，S100β，CNPase進(jìn)行免疫熒光和蛋白免疫印跡，評價EMSCs向雪旺細(xì)胞的分化效果。
　　6.EMSCs與大鼠脊髓來源神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行Transwell非接觸共培養(yǎng)，免疫熒光檢測評價該體系下EMSCs對神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的影響。
　　7.EMSCs與大鼠脊髓來源神經(jīng)干細(xì)胞接觸共培養(yǎng)，活細(xì)胞動態(tài)攝影及免疫熒光檢測評價該體系下EMSCs對神經(jīng)干細(xì)胞向

5、神經(jīng)細(xì)胞分化的影響。
　　8.接觸共培養(yǎng)體系中加入RGD，Integrinβ1抗體及BOC抗體，觀察并簡要探討RGD，Integrinβ1抗體及BOC抗體對神經(jīng)干細(xì)胞分化的抑制作用。
　　9.用掃描電子顯微鏡檢測(Scanning electron microscopy，SEM)及透射電子顯微鏡檢測(Transmission electron microscopy，TEM)觀察Fibrin支架的結(jié)構(gòu)特征。EMSCs種植于Fi

6、brin支架后，用蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)染色評價EMSCs與Fibrin支架的生物相容性。
　　10.用免疫熒光和蛋白免疫印跡檢測EMSCs在Fibrin支架上的自發(fā)分化情況。
　　11.用免疫熒光、蛋白免疫印跡、SEM和TEM等方法檢測EMSCs在Fibrin支架上向成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和雪旺細(xì)胞的誘導(dǎo)分化效果（方法同上述3-5）。
　　12.將EMSCs/Fibrin支架移植入大鼠脊

7、髓損傷(spinal cord injury，SCI)模型，觀察EMSCs在脊髓的遷移情況，BBB評分（Basso，Beattie，Bresnahan scoring）評價大鼠后肢運動功能恢復(fù)情況。用免疫熒光、免疫組化、TEM及蛋白免疫印跡等方法觀察評價損傷脊髓神經(jīng)元的再生情況。
　　結(jié)果:
　　1.鼻黏膜組織冰凍切片免疫熒光染色顯示，CD133，Nestin及CD44陽性細(xì)胞廣泛分布于鼻中隔兩側(cè)黏膜固有層內(nèi)。
　　2

8、.EMSCs在抗貼壁培養(yǎng)時，可形成CD133，Nestin及Sox1陽性的干細(xì)胞球。差速貼壁純化后的第三代EMSCs顯示出很強(qiáng)的干性，表達(dá)神經(jīng)外胚層干細(xì)胞相關(guān)蛋白和間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志蛋白Nestin，Sox1，Sox10，S100，Snail，Ⅵmentin，CD44，CD133，Sa114及含RGD序列細(xì)胞外基質(zhì)的受體integrinβ1等。
　　3.EMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)2周后，堿性磷酸酶活性明顯增強(qiáng)，成骨細(xì)胞標(biāo)志蛋白C

9、ollagen-Ⅰ、Osteocalcin、Osteopuntin及Runx2的表達(dá)量明顯升高。誘導(dǎo)3周后，茜素紅染色可觀察到大量的鈣結(jié)節(jié)。
　　4.EMSCs用神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后，神經(jīng)標(biāo)志蛋白Synapsin，Synaptotagmin，GAP43及NF-200的表達(dá)量明顯升高。
　　5.EMSCs用雪旺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后，雪旺細(xì)胞標(biāo)志蛋白GFAP，p75，S100β，CNPase的表達(dá)量明顯升高。

10、
　　6.EMSCs與脊髓來源的神經(jīng)干細(xì)胞的Transwell非接觸共培養(yǎng)結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組神經(jīng)突觸的數(shù)量和長度明顯增加，并可形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。
　　7.EMSCs與脊髓來源的神經(jīng)干細(xì)胞接觸共培養(yǎng)結(jié)果顯示，單神經(jīng)細(xì)胞組細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志蛋白GAP43及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白GFAP，而共培養(yǎng)組只表達(dá)GAP43，不表達(dá)GFAP。
　　8.接觸共培養(yǎng)體系中加入RGD，Integrinβ1抗體及BOC抗體后，神經(jīng)纖維的生長受到抑

11、制。
　　9.SEM和TEM檢測不同濃度Fibrin支架的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)低濃度(12.5-50mg/ml)的Fibrin支架呈疏松多孔的海綿狀結(jié)構(gòu)，并且隨著濃度升高，孔徑減小，密度增加。而當(dāng)纖維蛋白濃度達(dá)到75 mg/ml，纖維蛋白膠則聚集成塊狀結(jié)構(gòu)。HE染色結(jié)果顯示，EMSCs在低濃度Fibrin支架上生長良好。
　　10.免疫熒光和蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，EMSCs在Fibrin支架上培養(yǎng)12天后，可表達(dá)雪旺細(xì)胞標(biāo)志蛋白CNPa

12、se，MBP，GalCer及雪旺細(xì)胞可分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF，NGF，NT-3等。
　　11.免疫熒光、蛋白免疫印跡、SEM和TEM等結(jié)果顯示，EMSCs在Fibrin支架上也可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及雪旺細(xì)胞，并且分化效果優(yōu)于在L-多聚賴氨酸(poly-L-Lysine，PLL)對照組，而且EMSCs能夠改建Fibrin支架，使其更利于細(xì)胞的生長。
　　12.將EMSCs/Fibrin支架移植入大鼠脊髓損傷模型，

13、可觀察到EMSCs從移植處向脊髓兩端遷移。術(shù)后12周BBB評分結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠后肢運動功能恢復(fù)情況良好，而對照組無明顯恢復(fù)。免疫熒光、免疫組化、TEM及蛋白免疫印跡等結(jié)果顯示，EMSCs/Fibrin移植組神經(jīng)再生相關(guān)蛋白GAP43，NF-200及MBP的表達(dá)量明顯高于SCI組及Fibrin組，神經(jīng)再生能力明顯提高，神經(jīng)細(xì)胞被很厚的髓鞘包被。
　　結(jié)論:
　　1.EMSCs廣泛分布于嗅部和呼吸部黏膜固有層內(nèi)，并具有很強(qiáng)的干性，具

14、有向成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及雪旺細(xì)胞分化的潛能。
　　2.EMSCs與Fibrin支架生物相容性良好，并能在Fibrin支架上自發(fā)分化為雪旺細(xì)胞。
　　3.EMSCs在Fibrin支架上能更有效的分化為成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和雪旺細(xì)胞，并可以改建Fibrin支架，使之更利于EMSCs的生長分化。
　　4.EMSCs/Fibrin支架移植到大鼠橫斷脊髓損傷模型，能有效恢復(fù)大鼠后肢運動功能。EMSCs是組織工程中一種很有利用前景的