鎂通過(guò)調(diào)節(jié)鈣化相關(guān)因子的表達(dá)抑制血管鈣化.pdf

1、目的:血管鈣化是慢性腎臟病（CKD）患者的常見并發(fā)癥，與心血管疾病(CVD)死亡率密切相關(guān)。眾所周知除傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素，非傳統(tǒng)因素，如尿毒癥毒素、礦物質(zhì)代謝紊亂，尤其是高磷血癥，在血管鈣化的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。其中高磷可通過(guò)很多途徑誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)發(fā)生鈣化，如血管平滑肌細(xì)胞凋亡、骨源性分化、鈣化促進(jìn)因子（如:核心結(jié)合因子α-1）及抑制因子（如:基質(zhì)G蛋白;骨橋蛋白質(zhì)）的平衡紊亂等。因此由于血管鈣化發(fā)生的機(jī)制十分復(fù)雜，致

2、使目前對(duì)血管鈣化尚無(wú)有效的預(yù)防和治療方法。鎂離子作為體內(nèi)重要的陽(yáng)離子對(duì)維持血管彈性和心臟節(jié)律有重要的作用，因此近年來(lái)鎂離子與血管鈣化之間的關(guān)系備受關(guān)注，有臨床研究發(fā)現(xiàn)碳酸鎂可能會(huì)抑制冠狀動(dòng)脈鈣化的進(jìn)展，但鎂離子和血管鈣化之間的確切關(guān)系目前尚不完全明確，因此本研究旨在探討增加鎂離子濃度后對(duì)高磷誘導(dǎo)血管鈣化的影響及其可能的機(jī)制。
　　方法:
　　1、VSMCs原代培養(yǎng)
　　取5周齡雄性健康SD大鼠胸主動(dòng)脈通過(guò)組織貼壁法進(jìn)行

3、VSMCs原代培養(yǎng)，應(yīng)用形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)方法進(jìn)行平滑肌細(xì)胞鑒定。
　　2、實(shí)驗(yàn)干預(yù)及分組
　　隨機(jī)將VSMCs分為4組:(1)正常對(duì)照組:加入10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基;(2)高磷組:正常培基中加入10 mmol/Lβ-甘油磷酸（β-GP）;(3)鎂干預(yù)組:在高磷培基中加入3 mmol/L硫酸鎂(MgSO4);(4)鎂通道抑制劑(2-APB)干預(yù)組:高磷培基中加入3 mmol/L MgSO4及10-4 mol/L2-A

4、PB。各組VSMCs分別培養(yǎng)0、3、6、10、14天。
　　3、在培養(yǎng)14天后測(cè)定各組VSMCs的鈣化水平
　　各組VSMCs的鈣化染色應(yīng)用茜素紅(Alizarin red stain)方法;各組VSMCs鈣含量測(cè)定應(yīng)用鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法。
　　4、在培養(yǎng)14天后測(cè)定各組VSMCs的堿性磷酸酶(ALP)活性
　　將各組VSMCs培養(yǎng)14天后棄去其上清液，依據(jù)ALP活性試劑盒測(cè)定ALP活性，此過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)

5、明書進(jìn)行操作。
　　5、在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定各組VSMCs核心結(jié)合因子α-1(Cbfα1)mRNA的表達(dá)
　　應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR分別檢測(cè)0天、3天、6天、10天、14天時(shí)正常對(duì)照組、高磷組、鎂干預(yù)組以及14天時(shí)鎂通道抑制劑干預(yù)組Cbfα1 mRNA的表達(dá)。
　　6、在不同時(shí)間點(diǎn)分別檢測(cè)各組VSMCs中基質(zhì)G蛋白(MGP) mRNA和骨橋蛋白質(zhì)(OPN)mRNA的表達(dá)。
　　應(yīng)用RT-PCR分別檢測(cè)0天、3天、6天、10

6、天、14天時(shí)正常對(duì)照組、高磷組、鎂干預(yù)組以及14天時(shí)鎂通道抑制劑干預(yù)組VSMCs MGP mRNA和OPN mRNA的表達(dá)。
　　7、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)差異比較應(yīng)用單因素方差分析(ANOVA)，組間均數(shù)兩兩比較應(yīng)用SNK檢驗(yàn)， P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、大鼠VSMCs的原代培養(yǎng)
　　大鼠原代VSM

7、Cs采用組織塊貼壁法獲得，一般情況下動(dòng)脈組織塊貼壁后約3～4天即可爬出少量細(xì)胞，細(xì)胞形狀主要為長(zhǎng)梭形，并以束狀形式排列，組織塊貼壁6-7天后細(xì)胞融合成片，細(xì)胞形狀仍以梭形為主。當(dāng)細(xì)胞處于亞融合狀態(tài)時(shí)即可傳代，傳代后的細(xì)胞開始為橢圓形或者圓形，待細(xì)胞貼壁后可逐漸伸展為梭形，細(xì)胞漿豐富，細(xì)胞核呈圓形或者卵圓形，細(xì)胞重疊生長(zhǎng)，呈現(xiàn)出“峰-谷”樣。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體(α-SMA actin)是血管平滑肌細(xì)胞特異性抗體，免疫學(xué)方法檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)

8、果為平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)強(qiáng)表達(dá)α-SMA actin，胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色。
　　2、高鎂抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化及ALP活性
　　各組VSMCs鈣化染色結(jié)果:與正常對(duì)照組相比，高磷組可見大量橘紅色鈣鹽沉積;與高磷組相比，鎂干預(yù)組細(xì)胞鈣鹽沉積明顯減輕，鎂通道抑制劑干預(yù)組鈣鹽沉積比鎂干預(yù)組明顯增加。與鈣化染色相一致，鈣含量測(cè)定結(jié)果顯示鎂干預(yù)組明顯降低高磷誘導(dǎo)的鈣鹽沉積(P＜0.05），而這種作用可被2-APB抑制(P＜0.05）。

9、ALP活性測(cè)定結(jié)果顯示:鎂干預(yù)組ALP活性明顯低于高磷組及鎂通道抑制劑干預(yù)組(P＜0.05)。
　　3、高鎂抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs中骨源性因子Cbfα1的表達(dá)，并呈時(shí)間依賴性
　　RT-PCR結(jié)果顯示，培養(yǎng)14天后，鎂干預(yù)組Cbfα1的水平明顯低于高磷組及鎂通道抑制劑干預(yù)組(P＜0.05)。且動(dòng)態(tài)觀察Cbfα1的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)第3天時(shí)，高磷組Cbfα1表達(dá)即明顯增加(P＜0.05），并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì);而高鎂在

10、第3天時(shí)即明顯抑制了Cbfα1表達(dá)，長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中其抑制效果逐漸增強(qiáng)。
　　4、高鎂可上調(diào)鈣化相關(guān)抑制因子MGP和OPN的表達(dá)，并呈時(shí)間依賴性
　　RT-PCR結(jié)果顯示，培養(yǎng)14天后，鎂干預(yù)組MGP mRNA和OPNmRNA的表達(dá)水平高于高磷組及鎂通道抑制劑干預(yù)組(P＜0.05）。動(dòng)態(tài)觀察MGP mRNA和OPN mRNA的表達(dá)變化，結(jié)果顯示在培養(yǎng)第3天時(shí)，高磷組MGP mRNA和OPN mRNA表達(dá)水平均降低(P＜0.05

11、)，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì);在培養(yǎng)第3天時(shí)，高鎂抑制了高磷誘導(dǎo)的MGP mRNA和OPN mRNA表達(dá)下降的作用(P＜0.05)，且長(zhǎng)期（14天）暴露在高鎂環(huán)境中可逐漸增加MGP和OPN的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1、高濃度鎂離子可抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化。
　　2、高濃度鎂離子抑制VSMCs鈣化的機(jī)制可能是通過(guò)降低Cbfα1的表達(dá)抑制VSMCs表型轉(zhuǎn)化，并上調(diào)內(nèi)源性鈣化相關(guān)拮抗因子MGP及OPN的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，