高尿酸誘導血管鈣化的機制研究.pdf

1、背景：尿酸（UA）是嘌呤代謝產物。人類在進化的過程當中，由于尿酸酶的基因發(fā)生變異，致使其功能失活，使得人血UA濃度顯著高于其它哺乳類動物。近年來，大量的臨床調查及循證實踐證實高尿酸血癥（HUA）是心腦血管系統(tǒng)疾病獨立的危險因子。血管鈣化（VC）可導致血管脆性及僵硬度增加，增添了動脈斑塊、血管破裂及動脈瘤形成的危險性，是導致心肌梗塞、中風等心腦血管事件的重要危險因子。高尿酸是否通過誘導血管鈣化參與動脈硬化的發(fā)生和發(fā)展，從而誘發(fā)各種心血管疾

2、病值得探討。血管鈣化與血管壁細胞，尤其是血管的平滑肌細胞在各類刺激因素作用下活化，轉化成為成骨樣細胞密切相關。大量研究證實UA可以誘導血管平滑肌細胞（VSMC）增殖及氧化應激。高尿酸是否通過誘導VSMC分化成為成骨樣細胞，從而導致VC目前尚不清楚，對其進行深入研究，勢在必行。前期工作中，課題組在國際上首次在動物模型中發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥導致以早期出現(xiàn)彌漫性血管鈣化為特征的動脈硬化的直接證據?；谠摪l(fā)現(xiàn)，本課題擬對高尿酸血癥導致動脈硬化的機制進

3、行研究。
　　第一部分尿酸誘導大鼠原代平滑肌細胞向成骨樣細胞分化
　　目的：探討尿酸是否可以在一般培養(yǎng)環(huán)境中刺激血管平滑肌細胞向成骨樣細胞轉化。
　　方法：分離、培養(yǎng)大鼠胸主動脈平滑肌細胞，免疫組織化學方法檢測α-平滑肌肌動蛋白鑒定VSMC。
　?。?）含不同濃度尿酸（0μmol/L，200μmol/L，400μmol/L，800μmol/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng)血管平滑肌細胞24h，48h和72h后，CCK-8法檢測U

4、A對VSMC增殖的影響。
　　（2）含不同濃度尿酸（0μmol/L，200μmol/L，400μmol/L，800μmol/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng)血管平滑肌細胞，分別作用3天，7天，14天，每3天換液一次。采用堿性磷酸酶（ALP）試劑盒微量酶標法測定培養(yǎng)液中的ALP活性，并通過細胞蛋白定量計算相應的ALP活性值。
　?。?）將大鼠胸主動脈平滑肌細胞接種于24孔板，在含不同濃度尿酸（0μmol/L，200μmol/L，400μmol

5、/L，800μmol/L）培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天，用茜素紅礦化結節(jié)染色。
　?。?）將大鼠VSMC接種于6孔板，在含不同濃度尿酸（0μmol/L，200μmol/L，400μmol/L，800μmol/L）培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天。提取細胞總RNA，Real-Time PCR（RT-PCR）檢測成骨細胞骨樣標志物Runx2、BMP-2、OPN mRNA水平變化及平滑肌表型標志物SM22αmRNA水平變化。
　　（5）將大鼠VS

6、MC接種于6孔板，在含不同濃度尿酸（0μmol/L，200μmol/L，400μmol/L，800μmol/L）培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天。提取細胞總蛋白，蛋白質免疫印跡（WB）法檢測細胞Runx2蛋白表達。
　　結果：
　?。?）血管平滑肌細胞在尿酸濃度200μmol/L及400μmol/L作用下，細胞增殖，且呈濃度與時間依賴性。尿酸濃度在800μmol/L時，其增殖作用相比400μmol/L有減弱趨勢。
　?。?）尿酸

7、濃度為800μmol/L時，在作用7天和14天時ALP活性明顯增強，且隨著時間增加，其增加效果越明顯。但UA200μmol/L和400μmol/L，ALP活性隨作用時間增加趨勢不明顯。
　?。?）茜素紅染色未見顯著礦化結節(jié)出現(xiàn)。
　?。?）成骨樣標志物Runx2，BMP-2，OPN的mRNA水平在尿酸濃度800μmol/L明顯增高。平滑肌表型標志物SM22α各組見未有明顯差異。
　?。?）尿酸800μmol/L時，Ru

8、nx2蛋白表達明顯增高，其他濃度Runx2表達增高不明顯。
　　結論：尿酸可誘導VSMC增殖，高濃度尿酸可誘導成骨樣細胞標志物Runx2，BMP-2，OPN的mRNA表達，提示尿酸有誘導大鼠原代胸主動脈VSMC向成骨樣細胞分化的趨勢。
　　第二部分尿酸促進大鼠原代胸主動脈平滑肌細胞向成骨樣細胞分化及礦化
　　目的：探討在成骨誘導劑存在的前提下，尿酸促進VSMC成骨樣分化及礦化的能力。
　　方法：
　?。?）

9、含不同濃度尿酸（0，200，400和800μmol/L）+成骨誘導劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)血管平滑肌細胞24h，48h和72h后，CCK-8檢測尿酸對VSMC增殖的影響。（2）尿酸濃度0μmol/L+成骨誘導劑，200μmol/L+成骨誘導劑，400μmol/L+成骨誘導劑，800μmol/L+成骨誘導劑，作用14天，ALP試劑盒檢測相應的ALP活性。
　?。?）將大鼠VSMC接種于24孔板，在含不同濃度尿酸（0μmol/L，200μmol

10、/L，400μmol/L，800μmol/L）+成骨誘導劑培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天，用Von Kossa染色試劑盒進行鈣鹽沉積染色。
　　（4）將大鼠VSMC接種于24孔板，在含不同濃度尿酸（0μmol/L，200μmol/L，400μmol/L，800μmol/L）+成骨誘導劑培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天，用茜素紅進行礦化結節(jié)染色并進行定量鈣鹽分析。
　?。?）將大鼠VSMC接種于6孔板，在含不同濃度尿酸（0μmol/L，200μ

11、mol/L，400μmol/L，800μmol/L）+成骨誘導劑培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天。提取細胞總RNA，Real-Time PCR檢測檢測成骨細胞骨樣標志物Runx2、BMP-2、OPNmRNA水平變化及平滑肌表型標志物SM22αmRNA水平變化。
　?。?）將大鼠VSMC接種于6孔板，在含不同濃度尿酸（0μmol/L，200μmol/L，400μmol/L，800μmol/L）+成骨誘導劑培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天。提取細胞總蛋白

12、，Western Blotting方法檢測細胞Runx2蛋白表達。
　　結果：
　　（1）VSMC在尿酸濃度200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L聯(lián)合成骨誘導劑作用下，細胞增殖，且呈濃度與時間依賴性。
　?。?）尿酸作用于VSMC后ALP活性在尿酸濃度為400μmol/L、800μmol/L時明顯增高，且呈濃度依賴性增長。
　?。?）Von Kossa染色結果顯示，各組均有鈣鹽沉積，肉眼可見有

13、尿酸（200μmol/L，400μmol/L，800μmol/L）+成骨誘導劑組較對照組顏色稍深。
　?。?）茜素紅染色各組均有染色陽性的橘黃色沉淀，肉眼觀察UA800μmol/L+成骨誘導劑組染色最明顯。定量分析結果可見鈣鹽沉積呈尿酸濃度依賴性增長。
　　（5）成骨樣細胞標志物Runx2，BMP-2，OPN的mRNA表達在尿酸濃度400μmol/L+成骨誘導劑，800μmol/L+成骨誘導劑明顯增高，且呈濃度依賴性。平滑肌

14、表型標志物SM22α在800μmol/L+成骨誘導劑組較對照組明顯減少。
　?。?）尿酸400μmol/L+成骨誘導劑組，800μmol/L+成骨誘導劑組，Runx2蛋白表達較對照組明顯增高，且呈濃度依賴性。
　　結論：在成骨誘導劑存在時，高濃度尿酸可明顯促進大鼠胸主動脈平滑肌細胞向成骨樣細胞分化及礦化。
　　第三部分尿酸通過激活Wnt/β-catenin通路促進血管平滑肌細胞向成骨樣細胞分化
　　目的：探討尿酸

15、促進大鼠VSMC細胞向成骨樣細胞分化的機制。
　　方法：
　?。?）VSMC在不同濃度尿酸（0μmol/L，200μmol/L，400μmol/L，800μmol/L）+成骨誘導劑培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，48h后，進行ROS熒光探針-DHE染色及DAPI核染色。
　?。?）實驗分組 UA0μmol/L+成骨誘導劑，UA200μmol/L+成骨誘導劑，UA400μmol/L+成骨誘導劑，UA800μmol/L+成骨誘導劑，U

16、A800μmol/L+成骨誘導劑+Dkk-1，UA800μmol/L+成骨誘導劑+CHIR98014。連續(xù)培養(yǎng)14天，測相應的ALP活性。
　?。?）將大鼠 VSMC接種于6孔板。分組：UA0μmol/L+成骨誘導劑，UA200μmol/L+成骨誘導劑，UA400μmol/L+成骨誘導劑，UA800μmol/L+成骨誘導劑，UA800μmol/L+成骨誘導劑+Dkk-1，UA800μmol/L+成骨誘導劑+CHIR98014，連續(xù)

17、培養(yǎng)14天。提取細胞總RNA，Real-Time PCR檢測成骨細胞骨樣標志物mRNA水平變化。
　　（4）將大鼠 VSMC接種于6孔板。分組：UA0μmol/L+成骨誘導劑，UA200μmol/L+成骨誘導劑，UA400μmol/L+成骨誘導劑，UA800μmol/L+成骨誘導劑，UA800μmol/L+成骨誘導劑+Dkk-1，UA800μmol/L+成骨誘導劑+CHIR98014，連續(xù)培養(yǎng)14天。提取細胞總蛋白，Western

18、 Blotting法檢測細胞β-catenin，Runx2蛋白表達。
　　結果：
　　（1）DHE染色結果顯示，隨著尿酸濃度增加，VSMC內紅色熒光亮度逐漸增強，提示尿酸可誘導大鼠胸主動脈平滑肌細胞ROS生成，且其促進作用呈濃度依賴性。尿酸作用24h，48h，DHE染色隨時間同樣濃度有加深，呈時間依賴性。
　?。?）尿酸800μmol/L加入Wnt/β-catenin通路抑制劑Dkk-1后，ALP活性明顯降低，尿酸80

19、0μmol/L加入Wnt/β-catenin通路激活劑CHIR后，ALP活性略有升高。
　?。?）尿酸800μmol/L+成骨誘導劑在加入Wnt/β-catenin通路抑制劑Dkk-1后，Runx2、BMP-2、OPN的mRNA表達較單純尿酸800μmol/L+成骨誘導劑組均明顯降低。
　　（4）尿酸800μmol/L+成骨誘導劑+Dkk1組抑制了平滑肌細胞β-catenin，Runx2蛋白表達，而尿酸800μmol/L+成