血管鈣化相關(guān)因子在糖尿病鼠腎小動(dòng)脈中的表達(dá)及其與血管內(nèi)膜-中膜增厚關(guān)系的初步探討.pdf

1、背景和研究目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，其基本病理改變公認(rèn)為腎小球基底膜增厚、系膜基質(zhì)增生，最終彌漫性或結(jié)節(jié)性腎小球硬化。糖尿病的血管病變?nèi)鐒?dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，As)和血管鈣化(Vascular calcification)是糖尿病大血管并發(fā)癥研究中的焦點(diǎn)，尸檢發(fā)現(xiàn)腎動(dòng)脈也有粥樣斑塊和鈣化，但鮮有腎臟病理學(xué)家及腎臟病學(xué)家描述或研究腎實(shí)質(zhì)內(nèi)除腎動(dòng)脈外的

2、下級(jí)分支小動(dòng)脈的血管鈣化早期病灶及其相關(guān)因子表達(dá)以及這些因素在DM和DN發(fā)病機(jī)制中作用的報(bào)道。本文擬通過糖尿病動(dòng)物模型，連續(xù)多時(shí)點(diǎn)觀察核心結(jié)合因子a1(core bind factor alpha-1，Cbfa1)、骨形成蛋白2(Bonemorphogenetic protein-2，BMP-2)、基質(zhì)Gla蛋白(Matrix Gla Protein，MGP)以及單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant pr

3、otein-1，MCP-1)在糖尿病腎病鼠的腎臟實(shí)質(zhì)小動(dòng)脈中的表達(dá)，并探討血管內(nèi)膜/中膜增厚與血管鈣化相關(guān)因子及炎性因子MCP-1的關(guān)系，旨在研究糖尿病腎病早期腎臟實(shí)質(zhì)小動(dòng)脈中血管鈣化早期標(biāo)志表達(dá)的變化規(guī)律，探討血管鈣化在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中的作用，為糖尿病腎病的治療提供新的思路和新的靶點(diǎn)。 方法:雄性成年SD大鼠，標(biāo)準(zhǔn)化喂養(yǎng)。設(shè)糖尿病腎病、非洛地平干預(yù)和正常三組，每組4、8、12、16、24周5個(gè)觀察點(diǎn)，每時(shí)點(diǎn)6-7只鼠，糖尿

4、病腎病組采用鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)腹腔注射造模。處死前留尿、備血測(cè)常規(guī)生化指標(biāo)，分析各指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系。采用原位雜交技術(shù)、免疫組織化學(xué)染色以及實(shí)時(shí)熒光定量(Real-time PCR)檢測(cè)腎實(shí)質(zhì)內(nèi)小動(dòng)脈Cbfa1、BMP-2、MGP和MCP-1的蛋白和基因的表達(dá)，免疫熒光組化觀察內(nèi)膜/中膜厚度比，腎臟石臘切片普通病理觀察及茜素紅鈣特殊染色觀察血管鈣鹽沉積的情況。 結(jié)果:(1)Cbfa1免疫組化顯示在DN

5、組與DN-F組腎實(shí)質(zhì)小動(dòng)脈上有蛋白表達(dá)(小球上有微弱表達(dá)，小管上沒有表達(dá))，于4周開始上調(diào)，隨時(shí)間推移表達(dá)逐漸增強(qiáng)，24周表達(dá)最強(qiáng)，各時(shí)間點(diǎn)比較顯著高于N組，N組小動(dòng)脈有弱表達(dá)，各時(shí)間點(diǎn)無差異；Cbfa1原位雜交結(jié)果顯示只在腎小動(dòng)脈有mRNA表達(dá)，4周時(shí)有微弱表達(dá)，8周開始增強(qiáng)，主要表達(dá)于小動(dòng)脈內(nèi)彈力層和外彈力層，24周表達(dá)最強(qiáng)，16、24周小動(dòng)脈肌層表達(dá)亦增強(qiáng)，各時(shí)間點(diǎn)比較顯著高于N組，N組表達(dá)弱，各時(shí)間點(diǎn)無差異，DN組與DN-F組比

6、較無顯著差異。 (2)MGP Real-Time PCR顯示DN組與DN-F組4周表達(dá)量最高，8周稍降低，12周表達(dá)量稍有增加，16周后表達(dá)量顯著降低，24周最低，且低于N組，N組各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量無顯著差異。(3)BMP-2免疫組化顯示在DN組與DN-F組腎實(shí)質(zhì)小動(dòng)脈有表達(dá)(小球上、小管有弱表達(dá))，4周表達(dá)上調(diào)，隨時(shí)間推移表達(dá)逐漸增強(qiáng)，4、8周小動(dòng)脈內(nèi)彈力膜表達(dá)明顯，肌層表達(dá)較弱，12周后肌層表達(dá)亦明顯增強(qiáng)，24周達(dá)高峰，N組小動(dòng)脈上無表

7、達(dá)； Real-Time PCR顯示在DN組與DN-F組各時(shí)點(diǎn)BMP-2 mRNA表達(dá)量存在差異，4周表達(dá)量開始增加，12周稍下降，16、24周表達(dá)量持續(xù)增加，24周達(dá)高峰，各時(shí)間點(diǎn)比較明顯高于N組，N組內(nèi)比較無差異；原位雜交顯示在DN組與DN-F組BMP-2表達(dá)情況同Cbfa1原位雜交。 (4)MCP-1免疫組化顯示DN組與DN-F組在小動(dòng)脈、小球及小管均有表達(dá)，小動(dòng)脈4、8、12周表達(dá)無顯著差異，16、24周表達(dá)明顯上調(diào)，N組小動(dòng)脈

8、及小球沒有表達(dá)，僅在小管有微弱表達(dá)；原位雜交顯示DN組與DN-F組MCP-1小動(dòng)脈上有表達(dá)，4周開始有表達(dá)，8周表達(dá)增加，16、24周達(dá)高峰，DN組與DN-F組各時(shí)間點(diǎn)比較無顯著差異，N組腎小動(dòng)脈無表達(dá)。(5)茜素紅鈣染色顯示DN組與DN-F組早期(4、8周)腎實(shí)質(zhì)小動(dòng)脈上沒有鈣鹽沉積，中后期(16、24周)可見點(diǎn)狀甚至片狀沉積。(6)免疫熒光組化可見腎內(nèi)小動(dòng)脈內(nèi)膜呈紅色熒光，中膜呈綠色熒光，第4周時(shí)，DN組及DN-F組內(nèi)膜/中膜之比與

9、N組無明顯差異，第12周時(shí)DN組及DN-F組內(nèi)摸/中膜之比高于N組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，DN組與DN-F組間無顯著差異。第24周時(shí)DN與DN-F組內(nèi)膜/中膜之比高于N組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(7)DN組Cbfa1、BMP-2呈顯著正相關(guān)，它們與血脂、血磷、血肌酐、尿蛋白也呈明顯正相關(guān)；Cbfa1、BMP-2與MGP呈顯著負(fù)相關(guān)，Cbfa1與MCP-1、血鈣及尿素氮呈顯著正相關(guān)；MGP與血脂、血磷、血肌酐、尿蛋白卻呈明顯負(fù)相關(guān)。BMP-2、MGP

10、與MCP-1血鈣及尿素氮無明顯相關(guān)性。小動(dòng)脈內(nèi)膜/中膜之比與Cbfa1、BMP-2、MCP-1呈明顯呈正相關(guān)；與CHOL、TG呈顯著正相關(guān)：與血磷呈正相關(guān)；與血鈣呈正相關(guān)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：1．糖尿病腎病早期腎臟實(shí)質(zhì)內(nèi)小動(dòng)脈存在血管鈣化的早期標(biāo)志Cbfa-1的表達(dá)，且隨病程延長，促進(jìn)血管鈣化因子BMP-2表達(dá)逐漸增強(qiáng)，抑制血管鈣化因子MGP表達(dá)減弱；2．DN腎實(shí)質(zhì)小動(dòng)脈早期無鈣鹽沉積，中后期鈣鹽沉積逐漸增多；3．DN早期內(nèi)

11、膜/中膜厚度比無明顯變化，中期已有變化，后期變化明顯；4．血管鈣化前已先有鈣化形成相關(guān)因子MGP和BMP-2的表達(dá)，且MGP在血管鈣化早期表達(dá)增加，晚期表達(dá)下降，BMP-2卻在早期表達(dá)較弱，晚期表達(dá)增強(qiáng)，二者呈明顯負(fù)相關(guān)，提示MGP/BMP-2確是一對(duì)調(diào)節(jié)血管鈣化的并相互拮抗的因子；5．血管鈣化指標(biāo)與血脂、血磷、血肌酐及炎癥因子MCP-1等有明顯相關(guān)性，說明DN早期即存在的炎癥狀態(tài)(與內(nèi)膜增厚相關(guān))及代謝紊亂可以促進(jìn)腎實(shí)質(zhì)小動(dòng)脈鈣化。中