PDE4抑制劑氯比普蘭的分析方法及臨床前藥代動力學(xué)研究.pdf

1、磷酸二酯酶-4(phosphodiesterase4，PDE4)作為抑郁癥和阿爾茨海默病等疾病的潛在靶點已經(jīng)研究了二十多年，PDE4抑制劑的開發(fā)也為這類疾病的治療提供一定可能。但由于PDE4抑制劑嚴重的胃腸道不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐等阻礙了這一類藥物的進一步研究。如何減輕PDE4抑制劑的不良反應(yīng)又同時保持其藥理活性是這一類藥物開發(fā)的難點。本課題組通過對經(jīng)典的PDE4抑制劑進行結(jié)構(gòu)改造，成功地合成出了一系列化合物。通過酶活性測試我們從中篩選

2、出了一個具有代表性的化合物，(2-((3'-chloro-6-methoxy-[1，1'-biphenyl]-3-yl) methyl)-6-((2-(2-methoxyphenoxy) ethyl) amino) pyridazin-3(2H)-one(Chlorbipram，氯比普蘭)。前期實驗證實:1、氯比普蘭在體外實驗中對PDE4具有良好的抑制作用，且在120 min的觀察期內(nèi)比格犬無嘔吐反應(yīng);2、氯比普蘭對不同抑郁模型動物（如

3、急性抑郁模型小鼠、慢性不可預(yù)期溫和刺激模型大鼠）所表現(xiàn)出的焦慮和抑郁樣癥狀有明顯的改善作用;3、氯比普蘭能一定程度逆轉(zhuǎn)老年小鼠和由Aβ25-35誘導(dǎo)的AD模型大鼠所表現(xiàn)出的認知功能障礙。因此，氯比普蘭具有很好的開發(fā)前景。然而一個候選化合物能否脫穎而出，成功上市，除了要依賴于藥理毒理學(xué)效應(yīng)，它的藥代動力學(xué)和組織分布等性質(zhì)也十分重要。這直接影響到新化合物的用藥安全性和可靠性。所以，我們在臨床前對藥物的藥代動力學(xué)及組織分布等情況進行系統(tǒng)的研究

4、是非常必要的，它能提供藥物在動物體的吸收、轉(zhuǎn)運、分布、代謝和排泄(ADME)等信息，為臨床上預(yù)測人體內(nèi)的ADME信息、確定給藥劑量等提供參考。
　　本課題主要針對新型PDE4抑制劑氯比普蘭進行臨床前藥物代謝動力學(xué)研究，并對劑量與相應(yīng)的藥動參數(shù)之間的相關(guān)性進行研究，計算口服給予氯比普蘭后在動物體內(nèi)吸收的絕對生物利用度，同時根據(jù)所測得的氯比普蘭在血漿和腦組織中的分布情況，考察氯比普蘭是否可以透過血腦屏障進入腦組織，如若可以，則考慮其在

5、腦內(nèi)亞區(qū)的具體分布情況。本文分為以下三個部分：
　　第一部分：
　　目的：生物樣品中氯比普蘭UFLC-MS/MS分析方法的建立
　　方法：建立了靈敏度高、專屬性強的超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UFLC-MS/MS)的分析方法，測定生物樣品（昆明小鼠血漿和腦組織、SD大鼠血漿和腦組織）中氯比普蘭的濃度。實驗選用氯比普蘭的類似物ZXI14為內(nèi)標，乙酸乙酯萃取。采用Waters UPLC Acquity BEH C18柱(2.

6、1mm×50mm，1.7μm)，柱溫40℃，流動相采用水-甲醇進行梯度洗脫，流速為0.25 mL·min-1，進樣量5μl，分析時間5 min。氯比普蘭和ZXI14在正離子模式下，選用電噴霧離子源(ESI+)，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM);進一步優(yōu)化質(zhì)譜條件后，用于定量的離子通道分別為m/z492.6→231.3（氯比普蘭）和m/z452.8→191.2（內(nèi)標，ZXI14），響

7、應(yīng)較強且背景噪音低。
　　結(jié)論：所建立的SD大鼠血漿線性范圍為0.5-500ng/ml，腦組織樣品的線性范圍為0.25-100 ng/g，均線性良好;日間和日內(nèi)精密度(RSD)在11.7％以內(nèi);兩種樣品經(jīng)乙酸乙酯液液萃取后的提取回收率在77.7％-86.0％之間;基質(zhì)效應(yīng)在93.8％-101.8％之間，不影響測定;并且，大鼠血漿和腦組織樣品的各穩(wěn)定性考察均符合要求，說明該方法的穩(wěn)定、可靠。
　　結(jié)論：表明，所建立的生物樣品中

8、氯比普蘭分析方法的專屬性、線性范圍、精密度和準確度、回收率和基質(zhì)效應(yīng)等均符合生物樣品的分析要求，且方法簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可用于各生物樣品中氯比普蘭的含量測定。
　　第二部分：
　　目的：氯比普蘭在昆明小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)和腦組織分布研究
　　方法：采用180只健康、成年雄性昆明小鼠，將其分成4組，分別灌胃給予氯比普蘭低劑量、中劑量、高劑量（2.4 mg/kg、3.6 mg/kg、5.4 mg/kg），尾靜脈注射

9、給藥0.6 mg/kg，每個時間點5只小鼠，在給藥后不同時間點取血和腦組織樣本，預(yù)處理后，用所建立的氯比普蘭分析方法測定不同劑量和不同給藥方式下昆明小鼠血漿和腦組織中的藥物濃度。建立氯比普蘭血藥濃度-時間曲線和腦組織濃度-時間曲線，然后采用非房室模型法估算氯比普蘭在小鼠體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)，通過藥動參數(shù)計算口服給藥后氯比普蘭的絕對生物利用度;比較相同給藥劑量下血漿和腦組織樣品分布曲線圖，評價氯比普蘭透過血腦屏障的情況。
　　結(jié)果：昆明

10、小鼠單劑量口服氯比普蘭(2.4，3.6，5.4 mg/kg)后，其在小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)Cmax分別為11.3±2.0，28.5±3.5，30.5±7.3 ng/ml;tmax分別為12.0±4.5，15.0，15.0 min; t1/2分別為58.8±29.4，55.9±18.3，96.9±45.3min; AUC0-t分別為635.1±85.5，948.7±179.8，1628.0±270.5 ngmin/ml。氯比普蘭在小鼠體

11、內(nèi)吸收的相關(guān)藥代動力學(xué)參數(shù)與給藥劑量基本呈線性相關(guān)，如在2.4 mg/kg-5.4 mg/kg范圍內(nèi)，AUC0-t與劑量呈線性相關(guān)(R2=0.991)，Cmax也與劑量呈一定的相關(guān)性(R2=0.729)，這說明該藥物在小鼠體內(nèi)的吸收基本呈線性動力學(xué)特征，存在一定的劑量依賴性。
　　小鼠單劑量靜注氯比普蘭(0.6 mg/kg)后，經(jīng)過擬合，其在小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)Cmax、 t1/2、 AUC0-t分別為159.6±26.5ng

12、/ml，45.9±5.7min，4172.9±349、0ng min/ml。通過將口服給藥不同劑量的藥時曲線下面積AUC0-t與換算后的經(jīng)靜注給藥后的AUC0-t相比，計算得到氯比普蘭在低劑量、中劑量和高劑量口服給藥后的絕對生物利用度分別為3.8±0.4％，3.8±0.8％和4.4±1.0％，生物利用度較低。兩種給藥方式給予小鼠氯比普蘭后，在腦組織中均能檢測到分布。
　　結(jié)論：單劑量灌胃給予氯比普蘭(2.4、3.6、5.4mg/k

13、g)后，同樣采用非房室模型法進行估算，在小鼠腦組織中藥代動力學(xué)參數(shù)如下:tmax分別為17±7.6、14±2.2、27±6.7 min; t1/2分別為147.3±39.3、69.2±47.2、81.1±14.0 min; Cmax分別為4.73±0.53、4.60±0.78、9.4±0.6 ng/g。小鼠尾靜脈注射氯比普蘭（0.6mg/kg）后，腦組織中藥代動力學(xué)參數(shù):tmax為10 min; t1/2為47.2±8.5 min; C

14、max為83.5±11.0ng/g。這些參數(shù)中值得注意的是，單劑量靜注氯比普蘭(0.6 mg/kg)后，tmax為10 min左右，比在血漿中的達峰時間有所延遲，存在一定的吸收過程，峰值濃度為83.5±11.0 ng·mL-1，提示氯比普蘭可以透過血腦屏障。同樣的，口服給予三個劑量氯比普蘭后，其在小鼠腦組織中均能檢測到有分布，且吸收和分布的曲線趨勢與血漿中的相一致，再次提示氯比普蘭可以透過血腦屏障進入腦組織。
　　第三部分：

15、>　　目的：氯比普蘭在SD大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)及腦分區(qū)研究
　　方法：首先采用18只雄性SD大鼠，將其分成3組，分別口服給予氯比普蘭2mg/kg、4 mg/kg，靜注給藥1 mg/kg，在給藥后的不同時間點取血，同樣用第一部分所建立的分析方法測定大鼠血漿中的藥物濃度。建立相應(yīng)的血藥濃度-時間曲線，采用非房室模型法估算大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)并計算口服給藥后的絕對生物利用度。另取18只雄性SD大鼠，分成3組，3組均口服給予氯比普蘭4

16、 mg/kg，分別選取吸收相、消除相和達峰時間共三個時間點處死，在冰上取其海馬、前額皮質(zhì)、紋狀體及剩余大腦組織，測定不同部位腦組織中的氯比普蘭濃度。
　　結(jié)果：SD大鼠單劑量口服氯比普蘭（2 mg/kg和4 mg/kg）后，氯比普蘭在SD大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)Cmax分別為14.1±1.3，28.5±5.4 ng/ml; tmax為32.5±6.1，30 min; t1/2分別為175.2±45.6，105.6±38.3 min

17、，AUC0-t分別為1973.6±170.1，2866.0±534.9 ng min/ml。單劑量靜注氯比普蘭(1 mg/kg)后，其在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)Cma、t1/2、 AUC0-t分別為394.18±52.47 ng/ml，37.38±10.0minand13885.1±1031.3 ng min/ml。以SD大鼠單劑量靜注氯比普蘭(1mg/kg)后體內(nèi)血藥濃度-時間曲線下面積為參比，計算口服氯比普蘭(2mg/kg、4 mg