Rho GTP酶家族在黑素瘤細胞株中的表達及RhoD過表達對A375細胞骨架和遷移侵襲的影響及機制初探.pdf

1、皮膚惡性黑素瘤(cutaneous malignant melanoma, CMM)是惡性程度最高的皮膚腫瘤，近年來CMM發(fā)病率在世界范圍內(nèi)以3％-7％比例逐年上升，具有進展速度快、易于轉(zhuǎn)移、放化療不敏感、治療后易復(fù)發(fā)和預(yù)后差等特點。侵襲和轉(zhuǎn)移是影響該疾病患者生存的首要因素，是治療的最大障礙，也是造成該疾病臨床預(yù)后極差的關(guān)鍵因素，目前CMM的侵襲和轉(zhuǎn)移機制尚未完全闡明。細胞骨架重組是細胞遷移和侵襲所必需的，Rho GTPases家族是細

2、胞骨架的關(guān)鍵調(diào)控因子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展多個步驟和過程均可發(fā)揮重要作用。因此，我們以M14、A375和MV3三株人黑素瘤細胞和人黑色素細胞(Melanocyte，MC)為研究對象，探討Rho GTPases家族不同成員的表達及與細胞骨架、細胞遷移、侵襲的關(guān)系，然后選取該家族中在腫瘤細胞系及MC中表達差異最明顯的RhoD為進一步研究的目標，構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的過表達RhoD的A375細胞株，探討RhoD過表達對A375細胞株細胞骨架、遷移、侵襲等

3、生物學(xué)功能的影響及可能的機制。
　　本文主要從以下幾個方面進行論述：
　　第一部分 Rho GTPases家族在黑素瘤細胞骨架和遷移運動中的作用及分子機制
　　目的:黑素瘤遷移和侵襲轉(zhuǎn)移是影響患者生存的關(guān)鍵因素之一，細胞骨架重組是細胞遷移和侵襲所必需的，Rho GTPases家族是細胞骨架關(guān)鍵調(diào)控因子。本研究擬探討Rho GTPases家族不同成員在黑素瘤細胞中的表達，觀察細胞骨架的異同，揭示Rho GTPases家族

4、通過調(diào)節(jié)細胞骨架在黑素瘤遷移和侵襲中發(fā)揮的作用和分子機制。
　　方法:1、霍夫曼顯微鏡下觀察M14、A375和MV3三株人黑素瘤細胞與人黑色素細胞(Melanocyte，MC)形態(tài)學(xué)上的差異;羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽染色，在超高分辨率顯微鏡下觀察以肌動蛋白絲為主要組成成分的絲狀偽足、板狀偽足、應(yīng)力纖維和粘著斑在四種細胞中的差異。2、Transwell遷移實驗檢測M14、A375和MV3和MC四種細胞的遷移能力。3、實時熒光定量聚合酶鏈

5、反應(yīng)(Quantitative Real-timePolymerase Chain Reaction，QPCR)檢測Rho GTPases家族各成員的mRNA轉(zhuǎn)錄水平;免疫印跡法(western blotting，WB)檢測RhoD、Diaph2(diaphanous related formin2)、絲切蛋白Cofilin和磷酸化絲切蛋白(P-Cofilin)蛋白的表達。
　　結(jié)果:1、M14、A375和MV3和MC四種細胞絲狀

6、偽足、板狀偽足、應(yīng)力纖維和粘著斑具有明顯差異。MC無應(yīng)力纖維和粘著斑，M14、A375、MV3三種黑素瘤細胞雖然形態(tài)學(xué)不同，但均含有應(yīng)力纖維和粘著斑;MV3應(yīng)力纖維的數(shù)量少于M14和A375，但較后兩者粗;四種細胞都具有極細且短的絲狀偽足。2、Transwell遷移實驗結(jié)果顯示M14和A375細胞跨膜遷移能力類似，遷移率高;MV3細胞遷移率低于M14和A375，MC無跨膜遷移能力。3、Rho GTPases家族的不同成員在四種細胞中的Q

7、PCR結(jié)果各不相同，并且呈現(xiàn)與細胞骨架免疫熒光相對應(yīng)的變化;WB結(jié)果顯示Rho GTPases家族成員之一的RhoD在M14、A375、MV3中基本不表達，與QPCR水平變化一致，其下游效應(yīng)因子Diaph2亦出現(xiàn)了相對應(yīng)的變化;肌動蛋白絲重要調(diào)控因子cofilin蛋白雖沒有顯著變化，但是其磷酸化水平P-Cofilin在黑素瘤細胞中明顯高于黑色素細胞。
　　結(jié)論:Rho GTPases通過調(diào)節(jié)以肌動蛋白絲為主要組成成分的絲狀偽足、板

8、狀偽足、應(yīng)力纖維、粘著斑進而影響黑素瘤細胞遷移和侵襲;黑色素和黑素瘤細胞骨架和細胞遷移運動是不同Rho GTPases家族成員精準調(diào)節(jié)的結(jié)果。
　　第二部分 慢病毒介導(dǎo)的過表達RhoD人黑素瘤A375細胞株的構(gòu)建及鑒定
　　目的:構(gòu)建人RhoD基因的慢病毒載體并進行慢病毒包裝和鑒定，體外轉(zhuǎn)染人黑素瘤細胞A375，使其過表達RhoD蛋白，為后續(xù)研究RhoD在黑素瘤中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:1、利用Gateway技術(shù)構(gòu)

9、建攜帶增強型綠色熒光蛋白EGFP的RhoD慢病毒載體，經(jīng)PCR及基因測序鑒定后，與輔助質(zhì)粒pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4及pLV/helper-SL5混合采用脂質(zhì)體法制備DNA-Lipofectamine2000復(fù)合物，并共同轉(zhuǎn)染293FT細胞進行慢病毒包裝，產(chǎn)生相應(yīng)慢病毒顆粒，通過定量PCR方法測定病毒滴度。2、利用包裝好的慢病毒轉(zhuǎn)染人黑素瘤A375細胞，建立RhoD過表達的人黑素瘤A375細胞株，熒光顯微

10、鏡下觀察熒光表達情況，流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率;實驗分為A375（未處理對照組）、A375-EGFP（不含目的基因的空病毒對照組）和A375-RhoD（含RhoD基因的病毒組）三組，采用實時熒光定量PCR(QPCR)及免疫印記法（Western blot，WB）驗證RhoD在A375-RhoD組細胞中的過表達。
　　結(jié)果:1、通過PCR、基因測序證實，慢病毒表達載體pLV[Exp]-EGFP/Neo-CMV＞hRhoD構(gòu)建成功。與輔

11、助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細胞包裝出具高效感染力的慢病毒，經(jīng)測定病毒滴度為(5.13±2)×108 TU/ml。2、轉(zhuǎn)染A375細胞后，在細胞內(nèi)及細胞膜表面都有明顯的綠色熒光表達，流式檢測轉(zhuǎn)染效率大于80％; A375-RhoD組RhoD mRNA及蛋白水平均較A375-EGFP組和A375組細胞中明顯增高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建RhoD慢病毒表達載體，包裝出具高效感染力的慢病毒顆粒并成功轉(zhuǎn)染人黑素瘤A375細胞，為進一

12、步研究RhoD在黑素瘤中的作用提供實驗基礎(chǔ)。
　　第三部分 過表達RhoD對黑素瘤細胞A375細胞骨架和遷移侵襲的影響及作用機制的探討
　　目的:探討RhoD對人黑素瘤細胞株A375細胞骨架、遷移和侵襲能力等生物學(xué)行為的影響及其作用機制。
　　方法:采用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色觀察細胞骨架、Transwell小室實驗檢測細胞遷移及侵襲能力，流式細胞技術(shù)檢測細胞周期，觀察空白對照組A375、陰性對照慢病毒載體轉(zhuǎn)染組A375-

13、EGFP及過表達RhoD慢病毒載體轉(zhuǎn)染組A375-RhoD三組細胞的體外生物學(xué)行為改變;采用Western blot免疫印跡法比較三組細胞中Diaph2、cofilin和P-cofilin的表達情況，分析RhoD影響黑素瘤細胞骨架和運動、侵襲功能的可能機制。
　　結(jié)果:1、細胞骨架染色顯示，與A375和A375-EGFP組細胞對比， A375-RhoD組細胞體積增大，應(yīng)力纖維變細，軟弱無力，粘著斑增多;絲狀偽足形成增加;皺褶緣和板

14、狀偽足無明顯變化。2、Transwell小室遷移實驗顯示:A375、A375-EGFP和A375-RhoD組平均每視野穿膜細胞數(shù)分別為(149.67±11.93)、(152.67±11.23)和(72.67.25±5.03)，RhoD過表達可以顯著抑制黑素瘤細胞A375的跨膜運動和遷移能力(P＜0.05);Transwell小室人工基底膜侵襲試驗顯示:A375、A375-EGFP和A375-RhoD組平均每視野穿膜細胞數(shù)分別為（83±7

15、）、(78.33±12.34)和(9±1)，RhoD過表達可以顯著抑制黑素瘤細胞A375的侵襲能力(P＜0.05)。3、流式細胞技術(shù)分析細胞周期結(jié)果表明:A375、A375-EGFP和A375-RhoD三組細胞間G1期、S期和G2期細胞所占百分比無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.685、0.138和P=0.410），過表達RhoD和陰性對照慢病毒載體對細胞周期均無影響。5、WB免疫印跡結(jié)果顯示，A375-RhoD細胞可在RhoD的刺激下激活下游信號