LncRNA-RNCR2對糖尿病視神經病變的調控作用研究.pdf

1、目的:
　　探究長鏈非編碼RNA-RNCR2在糖尿病性視神經病變過程中的調控作用及作用機制。
　　方法:
　　1、首先通過腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)構建大鼠糖尿病模型，實驗分為四組:正常SD大鼠、4 W STZ-SD大鼠、8 W STZ-SD大鼠和12WSTZ-SD大鼠，qRT-PCR檢測各組視網膜中RNCR2的表達水平;構建視神經節(jié)細胞(Retinal ganglion cell，RGC)

2、和Müller細胞的高糖損傷模型，實驗分四組:正常濃度葡萄糖（5 mmol/L）、高濃度葡萄糖(30 mmol/L)24h、高濃度葡萄糖(30 mmol/L)48 h和高濃度葡萄糖（30 mmol/L）72 h，qRT-PCR檢測各組細胞中RNCR2的表達水平。
　　2、通過腹腔注射STZ構建大鼠糖尿病模型，實驗分為四組:正常SD大鼠、12 W STZ-SD大鼠、敲除RNCR2的12 W STZ-SD大鼠、敲除Scr-siRNA的

3、12WSTZ-SD大鼠，采用免疫熒光檢測各組大鼠視網膜中Müller細胞蛋白標記物GFAP、GS，RGC蛋白標記物Neun、TUBB3，雙極細胞:PKC-α、水平細胞:Calbindin和無長突細胞:Calretinin的表達情況。
　　3、利用高濃度葡萄糖(30 mmol/L)構建RGC、Müller細胞高糖模型，實驗分四組:對照組、高糖刺激組、下調Scr-siRNA的高糖刺激組、下調RNCR2的高糖刺激組。利用200μmol/

4、L H2O2構建RGC、Müller細胞氧化應激模型，實驗分四組:對照組、H2O2刺激組、下調Scr-siRNA的H2O2刺激組、下調RNCR2的H2O2刺激組。采用MTT實驗檢測各組細胞的活力;采用Hoechst染色、JC-1染色和PI/Calcein-AM染色檢測各組細胞凋亡和死亡情況;采用細胞免疫熒光染色Ki-67檢測各組細胞的增殖情況。
　　4、機制研究:通過Western blots技術檢測腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)

5、、神經生長因子(NGF)和重組人神經營養(yǎng)蛋白-3(NT-3)在大鼠視網膜中的表達水平。
　　結果:
　　1、在大鼠視網膜組織、RGC細胞和Müller細胞中均有RNCR2表達，且隨著STZ-SD大鼠、RGC細胞和Müller細胞在高糖環(huán)境下時間的延長，RNCR2的表達逐漸增加。
　　2、糖尿病大鼠視網膜中NeuN和TUBB3表達下降，GFAP和GS表達增加;下調RNCR2后NeuN、TUBB3表達進一步下降，GFAP和

6、GS表達下降;PKC-α、Calbindin和Calretinin的表達無顯著變化。
　　3、RGC和Müller細胞給予高糖或H2O2刺激后，細胞活力和增殖能力均下降，細胞死亡和凋亡數(shù)量增加;下調兩種細胞RNCR2的表達并給予高糖或H2O2刺激后，細胞活力和增殖能力進一步下降，細胞死亡和凋亡數(shù)量進一步增加。
　　4、糖尿病大鼠視網膜組織中BDNF、NT-3和NGF表達增加，敲除RNCR2后BDNF、NT-3和NGF表達明顯