MiR-106b在重復(fù)磁刺激下對(duì)體外神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 rMS對(duì)體外神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用的研究
　　研究目的：
　　通過rMS對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)進(jìn)行不同參數(shù)的刺激，比較這幾種參數(shù)下 rMS對(duì) NSCs增殖的效應(yīng)，確定最佳參數(shù)。并選用最佳參數(shù)刺激，檢測(cè) c-fos和p-CREB蛋白表達(dá)驗(yàn)證rMS對(duì)NSCs增殖作用機(jī)制。
　　研究方法：
　　取新生3天內(nèi)的Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠雙側(cè)海馬組織培養(yǎng) NSCs，通過cck-8試劑盒檢

2、測(cè)第2代NSCs的OD值繪制生長(zhǎng)曲線圖。再將第2代NSCs分為3組，A組為最大輸出強(qiáng)度25/50/100％，刺激頻率為10Hz，脈沖數(shù)200/d；B組為A組的最佳強(qiáng)度，刺激頻率為10Hz，脈沖數(shù)10/50/200/d；C組以最佳強(qiáng)度，最佳脈沖數(shù)，頻率分別為1Hz/10Hz/20Hz，干預(yù)方法均為間隔24h1次，刺激3天。最后1次干預(yù)后1h收集細(xì)胞，通過CCK-8測(cè)定的OD值檢測(cè)細(xì)胞增殖效應(yīng)確定最佳頻率，用Western Blot檢測(cè)c-

3、fos蛋白和環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(p-CREB)的表達(dá)量，分析rMS對(duì)NSCs的增殖作用機(jī)制。數(shù)據(jù)均采用單因素ANOVA分析，多重比較選用LSD法分析。
　　結(jié)果：
　　1.第2代神經(jīng)球生長(zhǎng)曲線提示第3天活性最佳。
　　2.用 CCK-8測(cè)定 rMS各組參數(shù)的OD值，發(fā)現(xiàn) NSCs在 A組參數(shù)下沒有顯著差異（p>0.05），選擇50%最大輸出強(qiáng)度進(jìn)行B組刺激后也發(fā)現(xiàn)沒有顯著差異（p>0.05），選擇每天刺激200

4、次脈沖進(jìn)行C組刺激后發(fā)現(xiàn)10Hz和20Hz與對(duì)照組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.03，p=0.046)。
　　3.用50%最大輸出強(qiáng)度，10Hz，每天200脈沖，刺激3天后western blot測(cè)定c-fos，p-CREB的蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示rMS干預(yù)組比對(duì)照組有顯著上升（p<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.10Hz、50%最大輸出強(qiáng)度，200脈沖/天的rMS對(duì)NSCs的增殖作用最強(qiáng)。
　　2. rMS能促進(jìn)體

5、外NSCs的c-fos蛋白的表達(dá)和CREB蛋白的活化增加，可能是體外rMS刺激NSCs增殖的原因之一。
　　第二部分 mir-106b在rMS下對(duì)體外神經(jīng)干細(xì)胞增殖機(jī)制的研究
　　研究目的：為了進(jìn)一步探討參數(shù)的脈沖刺激量與NSCs增殖的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)再次對(duì)體外培養(yǎng)NSCs進(jìn)行不同脈沖數(shù)的rMS參數(shù)刺激，同時(shí)檢測(cè)了NSCs的增殖率，以期觀察量效關(guān)系。檢測(cè)microRNA-106b家族成員的表達(dá)，以期解釋NSCs在rMS下促增殖的

6、機(jī)制。
　　研究方法：用10Hz，50%最大輸出量(3.5T)，脈沖刺激量為每天200、400、600、800、1000脈沖干預(yù)體外NSCs，干預(yù)3天最后1次干預(yù)后1h收集細(xì)胞，測(cè)量以下相關(guān)指標(biāo)：Ki67、EdU免疫熒光染色測(cè)定增殖細(xì)胞率；Western blotting檢測(cè) ki67、p21、cyclinD1、cyclinE、cyclinA、cdk2、cdk4蛋白表達(dá)量；qRT-PCR檢測(cè)microRNA-106b、microR

7、NA-93、microRNA-25表達(dá)量。rRT-PCR圖像分析采用2-△△t均值方法。數(shù)據(jù)分析采用單因素ANOVA分析和多重比較選用sidark法。
　　研究結(jié)果：
　　1.ki67免疫熒光染色在 rMS800脈沖/d、1000脈沖/d與空白對(duì)照組比較有明顯增高（p<0.01），1000脈沖/d組的陽性細(xì)胞率(20.65%）比空白組(9.25%）明顯增加。ki67的蛋白表達(dá)量在600-1000脈沖/d與空白對(duì)照組比較有上升

8、（p<0.01）。
　　2.EdU的陽性細(xì)胞率隨刺激脈沖數(shù)增加而增加，由空白組的2.05%增加到1000脈沖組的4%，并在600脈沖/d與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.026），800、1000脈沖/d與空白組比較有明顯增高（p=0.000）。
　　3. rMS對(duì)體外神經(jīng)干細(xì)胞的刺激使mir-106b家族各成員表達(dá)趨勢(shì)不同。與空白對(duì)照組比較，mir-106b和mir-93在600脈沖/d組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p=0.013，p=

9、0.015），800、1000脈沖/d組為明顯上升（p=0.000）。與空白對(duì)照組比較，mir-25在400、600、800、1000脈沖/d組下降有顯著性差異（p<0.01）。
　　4. p21蛋白相對(duì)表達(dá)量隨著脈沖刺激數(shù)目的增加而下降，與空白對(duì)照組比較，在800和1000脈沖/d組明顯下降（p=0.001&p=0.000）。
　　5.cyclinD1、cyclinA、cyclinE、cdk2、cdk4蛋白含量均隨脈沖刺激

10、數(shù)增加而表達(dá)增加。cyclinD1在800、1000脈沖/d組有顯著性上升（p=0.006,p=0.002）；cyclinA在600、800脈沖/d組表達(dá)上升（p=0.03，p=0.016），1000脈沖/d組表達(dá)明顯上升(p=0.000)；cyclinE從200脈沖/d組開始上升（p=0.018），400脈沖/d組開始明顯上升（p<0.01）；cdk2在400脈沖/d組上升（p=0.012），600-1000脈沖組明顯上升(p<0.0

11、1)；cdk4在1000脈沖組/d與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.013）。
　　結(jié)論：
　　1.rMS能促進(jìn)體外NSCs的增殖，增殖程度隨著脈沖刺激量的增加而增加。
　　2.rMS促進(jìn)體外NSCs增殖的機(jī)制與促進(jìn)mir-106b/p21/cdks/cyclins通路相關(guān)。
　　第三部分過表達(dá)/抑制mir-106b在rMS下對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響
　　研究目的：分別通過慢病毒和Lipo2000轉(zhuǎn)染

12、神經(jīng)干細(xì)胞促進(jìn)/抑制mir-106b表達(dá)，研究 mir-106b對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的作用，進(jìn)一步證實(shí) rMS對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖作用與mir-106b家族密切相關(guān)。
　　研究方法：分別通過慢病毒/Lipo2000轉(zhuǎn)染siRNA神經(jīng)干細(xì)胞，使其促進(jìn)/抑制mir-106b表達(dá)。分為 sham+rMS組，空病毒/anti-mir106b陰性對(duì)照組，空病毒+rMS組/anti-mir106b陰性對(duì)照+rMS組，mir-106b過表達(dá)組/anti-

13、mir106b組，mir-106b+rMS組/anti-mir106b+rMS組。干預(yù)參數(shù)為：10Hz，50%最大輸出，每天1000脈沖，干預(yù)3天后進(jìn)行 EdU熒光染色，western blot檢測(cè) p21，qRT-PCR檢測(cè) mir-106b。采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方法采用單因素ANOVA分析和LSD法分析。
　　研究結(jié)果：
　　1.載體構(gòu)建成功，慢病毒rLV-miR-106b滴度為：1.0x108

14、TU/ml。
　　2.EdU陽性細(xì)胞在mir-106b過表達(dá)組與空病毒組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，陽性細(xì)胞比例明顯升高（p<0.01），mir-106b過表達(dá)+rMS組又較 mir-106b過表達(dá)組明顯增高（p<0.01）。EdU陽性細(xì)胞在anti-mir106b+rMS組與anti-mir106b陰性對(duì)照組顯著高于anti-mir106b組（p均為<0.01），anti-mir106b陰性對(duì)照+rMS組顯著高于anti-mir106b

15、陰性對(duì)照組（p<0.01）。
　　3.qRT-PCR的結(jié)果表明NSCs的mir106b表達(dá)量在mir106b過表達(dá)組與空病毒組+rMS組明顯比空病毒組表達(dá)上升（p<0.01），并且 mir106b過表達(dá)+rMS組又比 mir106b過表達(dá)組明顯升高（p<0.01）。發(fā)現(xiàn)在anti-mir106b+rMS組與anti-mir106b陰性對(duì)照組顯著高于anti-mir106b組（p均為<0.01），anti-mir106b陰性對(duì)照+r

16、MS組顯著高于anti-mir106b陰性對(duì)照組（p<0.01）。
　　4.p21在mir-106b過表達(dá)組明顯比空病毒組有顯著下降（p<0.01），mir-106b過表達(dá)+rMS組明顯較mir-106b過表達(dá)組下降（p<0.01），空病毒+rMS組較空病毒組明顯下降（p<0.01）。p21在 anti-mir106b+rMS組和 anti-mir106b陰性對(duì)照+rMS組較anti-mir106b組降低（p<0.01），anti