MDSC誘導(dǎo)CD19hiFcγRⅡbhi調(diào)節(jié)性B細胞產(chǎn)生及其機制研究.pdf

1、髓系抑制性細胞(MDSC)是一群具有很強免疫抑制功能的細胞，在腫瘤和炎癥等疾病的進展和轉(zhuǎn)歸過程中起著重要調(diào)節(jié)作用。但以往的研究主要集中于它們對T細胞和NK等細胞免疫應(yīng)答的調(diào)控作用。它們對于B細胞的功能調(diào)控作用還不是十分清楚，尤其是對于調(diào)節(jié)性B細胞的分化調(diào)控作用目前尚未見報道。因此，本研究主要圍繞MDSC對調(diào)節(jié)性B細胞的分化調(diào)控及相關(guān)的機制進行了探討。
　　第一部分:MDSC誘導(dǎo)高分泌IL-10的B細胞產(chǎn)生
　　為了探討MDS

2、C能否誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性B細胞的分化，我們將小鼠MDSC與不同刺激劑活化的B細胞（anti-IgM、可溶性CD40L、LPS）共培養(yǎng)，檢測共培養(yǎng)后上清中IL-10的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS刺激后的B細胞與MDSC共培養(yǎng)后其上清中IL-10的分泌水平明顯增高。接著我們通過胞內(nèi)染色的方法分別檢測了共培養(yǎng)前后B細胞及MDSC胞內(nèi)IL-10表達水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)之后B細胞胞內(nèi)IL-10的表達水平明顯增高，而MDSC共培養(yǎng)前后IL-10的表達

3、沒有明顯變化。隨后我們將共培養(yǎng)體系中的MDSC與B細胞通過流式分選出來，分別提取其總RNA，利用qRT-PCR的方法檢測其IL-10的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)體系中的IL-10主要來源于B細胞。進一步的檢測發(fā)現(xiàn)該群高分泌IL-10的B細胞表達獨特表型即CD19hiFcγRⅡbhi。此外，我們通過流式分選出不同亞群的MDSC(粒系及單核系MDSC)，將其分別與LPS活化B細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)不論是粒系MDSC還是單核系MDSC均能誘導(dǎo)LPS活化

4、B細胞高分泌IL-10。另外，我們分選出脾臟不同亞群的B細胞，經(jīng)LPS活化后分別與MDSC共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MDSC誘導(dǎo)后，T1，T2，T3及MZB細胞均能夠高分泌IL-10。在體內(nèi)實驗中，我們將CFSE標記的LPS活化B細胞，單獨或與MDSC共同尾靜脈注射小鼠，取小鼠脾臟，流式胞內(nèi)染色法檢測CFSE+B細胞分泌IL-10的情況，發(fā)現(xiàn)在與MDSC共注射的情況下，B細胞分泌IL-10的水平增強。以上結(jié)果說明:MDSC能夠誘導(dǎo)高分泌IL-

5、10的CD19hiFcγRⅡbhiB細胞產(chǎn)生。
　　第二部分:MDSC的CD19hiFcγRⅡbhi調(diào)節(jié)性B細胞的功能及其機制研究
　　為了研究MDSC誘導(dǎo)產(chǎn)生的高分泌IL-10的具有CD19hiFcγRⅡbhi表型的B細胞對T細胞是否具有調(diào)節(jié)功能，我們先通過流式將MDSC與B細胞共培養(yǎng)體系中CD19hiFcγRⅡbhi及CD19lowFcγRⅡblowB細胞分選出來，分別與帶有CFSE標記且經(jīng)抗CD3/CD28活化的CD4

6、+T細胞共培養(yǎng)，3天以后檢測T細胞增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD19hiFcγRⅡbhiB細胞能夠明顯抑制活化的CD4+T細胞增殖，且在共培養(yǎng)體系中加入IL-10的中和性抗體后，CD4+T細胞可恢復(fù)增殖，這一結(jié)果提示CD19hiFcγRⅡbhiB細胞可以通過其分泌的IL-10抑制活化T細胞增殖。另外，我們檢測了CD19hiFcγRⅡbhiB細胞和CD19lowFcγRⅡblowB細胞對活化CD4+T細胞表面CD69分子表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD1

7、9hiFcγRⅡbhiB和CD19lowFcγRⅡblowB細胞對CD69的表達均沒有明顯影響，以上結(jié)果提示CD19hiFcγRⅡbhiB細胞并非通過抑制T細胞活化，而是通過抑制已活化T細胞的增殖發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。此外，我們還檢測了CD19hiFcγRⅡbhiB細胞和CD19lowFcγRⅡblowB細胞對活化CD4+T細胞分泌IL-4及IFN-γ的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（數(shù)據(jù)未顯示），CD19hiFcγRⅡbhiB和CD19lowFCγRⅡblo

8、wB細胞不能影響CD4+T細胞向Th1及Th2方向的分化。
　　在對機制的研究上，首先我們利用transwell系統(tǒng)將MDSC與B細胞隔離，共培養(yǎng)48h后檢測上清中IL-10的分泌情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MDSC誘導(dǎo)B細胞產(chǎn)生IL-10。此外，將MDSC培養(yǎng)上清與LPS活化B細胞共培養(yǎng)后，與單獨的LPS活化B細胞相比，IL-10的水平也沒有明顯變化。我們探索了MDSC上哪些膜分子參與誘導(dǎo)了調(diào)節(jié)性B細胞高分泌IL-10。已有研究表明:CD4

9、0L-CD40通路在調(diào)節(jié)性B細胞的分化中起到著重要作用。通過流式檢測我們發(fā)現(xiàn)， MDSC表面表達CD40L分子，B細胞表面表達CD40分子，且B細胞經(jīng)LPS活化后其表面CD40的表達量增加，另外，在B細胞中加入可溶性CD40L可使其上清中IL-10的表達水平增高。下一步我們將用CD40-/-小鼠的B細胞與CD40L-/-小鼠的MDSC共培養(yǎng)，檢測上清及胞內(nèi)IL-10的分泌情況，從而明確CD40L-CD40通路在MDSC誘導(dǎo)高分泌IL-1

10、0調(diào)節(jié)性B細胞產(chǎn)生過程中的作用。
　　總之，本研究發(fā)現(xiàn)粒系和單核系MDSC均能夠促進LPS活化后的脾臟B細胞分化為高分泌IL-10的，表型為CD19hiF cγRⅡbhi的調(diào)節(jié)性B細胞，該群B細胞通過其分泌的IL-10抑制活化CD4+T的增殖。本研究提出了MDSC負向調(diào)控免疫應(yīng)答的新機制，即通過促進調(diào)節(jié)性B細胞的分化從而進一步擴大其獨特的免疫負向調(diào)節(jié)功能，有助于更全面地認識MDSC對免疫應(yīng)答多細胞網(wǎng)絡(luò)的負向調(diào)控功能，并使我們對調(diào)節(jié)