TGF-β誘導的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞對膠原誘導性關節(jié)炎的抑制作用及機制研究.pdf

1、類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是以慢性、進展性和侵蝕性關節(jié)炎為特點的一類自身免疫性疾病，最終表現(xiàn)為骨質(zhì)的破壞、關節(jié)的畸形，致殘率極高。目前RA的治療以免疫抑制劑為主，但治療的副作用較大。
　　 已知CD4+CD25+Foxp3+的天然調(diào)節(jié)性T細胞(Natural Ocurring Regulatory TCells，nTregs)數(shù)量的減少和/或功能的降低與RA的發(fā)病有關。有學者發(fā)現(xiàn)，在RA小鼠

2、模型輸注nTregs可以預防關節(jié)炎的發(fā)生和減輕關節(jié)炎的嚴重程度。但是，在已發(fā)病的RA經(jīng)典小鼠模型--膠原誘導性關節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)中，即使額外輸注nTregs，對關節(jié)炎也沒有起到改善作用。近來，本研究小組發(fā)現(xiàn)，TGF-β誘導的調(diào)節(jié)性T細胞(Induced Regulatory T cells，iTregs)不僅具有與nTregs相同的表型和抑制關節(jié)炎發(fā)病的功能，而且在體外促炎癥因子白介素

3、-6(Interleukin6，IL-6)的作用下能表現(xiàn)出更強的穩(wěn)定性和對效應性T淋巴細胞的抑制力。因此，本論文第一部分的研究旨在比較nTregs和iTregs對CIA預防與治療作用的差異。
　　 關節(jié)破壞是RA患者最常見的癥狀和轉歸，破骨細胞在RA患者的骨質(zhì)重建中發(fā)揮重要作用；破骨細胞是一種多核巨細胞，主要功能是骨質(zhì)吸收，生理條件下與成骨細胞一起維持骨代謝的平衡；而破骨細胞的過度激活和功能異常被認為是炎性關節(jié)病人骨質(zhì)侵蝕的重要

4、誘因；已有報道在RA的CIA小鼠模型中觀察到破骨細胞前體細胞(Osteoclast precursors，OCPs)的數(shù)量增多。破骨細胞起源于骨髓，其前體細胞在轉錄因子-κB受體激活因子配體(Receptor Activator ofNuclear Factor-κB，RANKL)和巨噬細胞集落刺激因子(MacrophageColony-stimulating Factor，M-CSF)的共同作用下，進一步分化為成熟的破骨細胞；RANK

5、L和M-CSF是破骨細胞生成過程所必須的兩個細胞因子，任何一個缺失或信號途徑的阻斷都會影響破骨細胞的分化。因此，破骨細胞的生成已成為關節(jié)炎關節(jié)破壞及治療的重要靶點。已有報道證實，激活的nTregs可以抑制破骨細胞的生成，而iTregs具有與nTregs相似的表型和抑制功能。因此，本論文第二部分研究是在第一部分研究的基礎上，探討iTregs是否可以通過抑制破骨細胞的生成而發(fā)揮其對CIA模型動物的骨質(zhì)侵蝕及破壞的抑制能力。
　　 實

6、驗結果：
　　 第一部分：TGF-β誘導的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞制備、鑒定及對膠原誘導性關節(jié)炎的抑制、治療作用1.TGF-β誘導的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞的制備、鑒定自DBA1/J小鼠的脾臟分離出幼稚的CD4+細胞。以牛CⅡ型膠原(bovinecollagenⅡ，CⅡ)多肽、白介素-2(Interleukin-2，IL-2)和TGF-β誘導Tregs(iTregs)，單用IL-2培養(yǎng)的細胞為

7、效應性T淋巴細胞，作為Tregs的對照(Tcon)。nTregs分離自同種小鼠的胸腺，在培養(yǎng)液中加入IL-2進行體外擴增，流式細胞儀、Western Blotting和PCR法分別檢測Foxp3的表達；同時nTregs和iTregs分別與效應性T淋巴細胞共培養(yǎng)(綠色熒光蛋白CFSE標記法和增生實驗)，比較兩者對效應性T淋巴細胞增生的抑制能力，實驗設立基線值(baseline)、nTregs組、Tcon組和iTregs組。
　　

8、1.1 TGF-β誘導的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞Foxp3的表達流式細胞儀的結果顯示，經(jīng)過擴增的nTregs與誘導的iTregs，F(xiàn)oxp3的表達相近，多在60％以上，而Tcon Foxp3的表達僅為10％左右。計數(shù)培養(yǎng)孔內(nèi)的CD25+Foxp3+細胞數(shù)，Tcon組的細胞數(shù)顯著低于iTregs組。Western Blotting檢測CD4+CD25-細胞、nTregs、Tcon和iTregs Foxp3蛋白的表達水平，

9、nTregs與iTregsFoxp3蛋白的表達相近并均顯著高于CD4+CD25-細胞和Tcon。PCR法檢測Foxp3mRNA的水平，nTregs與iTregs Foxp3 mRNA的水平相近并均顯著高于CD4+CD25-細胞和Tcon。
　　 1.2 TGF-β誘導的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞對效應性T淋巴細胞的抑制能力體外CFSE標記法與增生實驗法均證實，與基線值、Tcon組相比，iTregs擁有與nTreg

10、s相似的對效應性T淋巴細胞增生的抑制功能，而Tcon則與基線值相近，無法抑制T淋巴細胞的增生。
　　 2 TGF-β誘導的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞對CIA的抑制和治療作用采用牛Ⅱ型膠原(4mg/mL)和完全弗式佐劑(體積比1:1)乳化液50ul于小鼠尾根部皮下注射誘導關節(jié)炎小鼠模型，在免疫后的第0天、第14天和第28天分別自小鼠尾靜脈輸注3×106 nTregs或iTregs，小鼠隨機分為4組：CIA模型組、n

11、Tregs注射組、Tcon組和iTregs組，發(fā)病后隔天觀察小鼠關節(jié)炎的發(fā)病率及臨床評分。檢測血清抗CⅡ特異性抗體的水平以及關節(jié)組織學染色，進一步評估疾病的嚴重程度。
　　 2.1 TGF-β誘導的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞對CIA的預防作用在DBA1/J小鼠免疫后的第0天分別注射nTregs和iTregs，兩者都可顯著抑制關節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展；在免疫后的第14天分別注射nTregs和iTregs，iTregs仍可

12、降低關節(jié)炎的發(fā)生，兩者均可顯著降低關節(jié)炎的臨床評分；并且檢測血清抗CⅡ特異性抗體水平發(fā)現(xiàn)，兩種Tregs均可顯著抑制抗CⅡ IgG2b的水平。
　　 2.2 TGF-β誘導的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞對CIA的治療作用在DBA1/J小鼠免疫后的第28天(即關節(jié)炎發(fā)病后)分別注射nTregs和iTregs，iTregs而非nTregs可以顯著抑制關節(jié)炎的發(fā)生和嚴重程度，以及血清抗CⅡ IgG2a和IgG2b的水平；

13、病變關節(jié)組織學染色顯示，iTregs可以顯著抑制關節(jié)炎性細胞的浸潤及骨質(zhì)破壞的發(fā)生；分離自關節(jié)炎小鼠體內(nèi)的淋巴細胞體外增生實驗顯示，iTregs尚可抑制淋巴細胞的增生程度和促炎癥因子的水平；而nTregs則完全喪失了對關節(jié)炎的保護作用。
　　 小結：
　　 以上實驗結果表明，iTregs擁有與nTregs相似的表型和對T淋巴細胞增生的抑制能力；同時，對CIA具有與nTregs相似的預防作用；但在已發(fā)病的關節(jié)炎小鼠，iTr

14、egs而非nTregs具有明確的治療作用且抑制了關節(jié)破壞的發(fā)生，nTregs則完全喪失了對關節(jié)炎的保護作用。
　　 第二部分：TGF-β誘導的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞預防和治療CIA的機制研究基于第一部分的研究結果，iTregs較nTregs在已發(fā)病的關節(jié)炎小鼠具有穩(wěn)定的治療作用，并可抑制骨質(zhì)破壞的發(fā)生，我們在本部分將進一步探究其作用機制。
　　 3 TGF-β誘導的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性

15、T細胞在體內(nèi)、外的穩(wěn)定性按照1中的描述分別制備nTregs與iTregs，進行如下實驗：
　　 3.1 TGF-β誘導的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞在體外的穩(wěn)定性采用與1.2相同的CFSE標記法與增生實驗鑒定兩者對效應性T淋巴細胞的抑制作用，同時設立IL-6添加組(IL-6+)與非添加組(IL-6-)，檢測在促炎癥因子IL-6存在的情況下，兩種Tregs抑制力的變化。建立Th17細胞培養(yǎng)體系即IL-6+TGF-β誘

16、導幼稚的CD4+細胞向Th17細胞轉化，在培養(yǎng)液中同樣分別加入nTregs、iTregs(Tregs：幼稚CD4+細胞=1:4)，比較兩組IL-17A生成的水平。
　　 結果顯示，在IL-6作用下，nTregs而非iTregs顯著地喪失了其對效應性T淋巴細胞的抑制作用，并且無法抑制Th17細胞的分化及IL-17A的生成；而iTregs則始終保持著良好的抑制能力。
　　 3.2 TGF-β誘導的CD4+CD25+Foxp3

17、+調(diào)節(jié)性T細胞在體內(nèi)的穩(wěn)定性來自GFP-Foxp3轉基因小鼠的nTregs和iTregs分別注射入免疫缺陷(CD3-/-)的小鼠體內(nèi)，分別在注射后4周和8周觀察Foxp3水平的變化；綠色熒光蛋白CFSE標記來自正常DBA1/J小鼠的兩種Tregs并注射到同種小鼠體內(nèi)，分別在注射后的1周和3周，檢測兩種Tregs Foxp3水平的變化；另將標記了CFSE的兩種Tregs分別注射入已發(fā)病的關節(jié)炎小鼠(炎性小鼠)體內(nèi)，觀察兩種Tregs在炎性

18、環(huán)境下的穩(wěn)定性和轉歸。
　　 3.2.1 TGF-β誘導的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞在免疫缺陷和正常小鼠體內(nèi)環(huán)境下的穩(wěn)定性在注射后4周和8周，nTregs和iTregs同樣可以維持Foxp3的表達，F(xiàn)oxp3表達占CD3+細胞的百分比為50％左右。在正常體內(nèi)環(huán)境下，nTregs和iTregs同樣可以維持Foxp3的表達在50％左右(Foxp3占CFSE+細胞的百分比)。
　　 3.2.2 TGF-β誘導的

19、CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞在關節(jié)炎小鼠炎性環(huán)境下的穩(wěn)定性實驗結果顯示，相對于iTregs，nTregs在細胞注射后1周的關節(jié)炎小鼠的引流淋巴結內(nèi)，更易于凋亡、Foxp3的表達丟失并向Th2和Th17細胞轉化；相反，iTregs在相似的炎性環(huán)境下能夠維持Foxp3的表達且不會向輔助性T淋巴細胞轉化。在nTregs注射組的關節(jié)炎小鼠淋巴結細胞中，Th17細胞的數(shù)量是iTregs組的10倍，而CFSE+Foxp3+細胞的數(shù)量為

20、iTregs組的八分之一，提示了iTregs能夠在炎性環(huán)境下誘導出更多的Foxp3+的調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生。
　　 4 TGF-β誘導的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞通過抑制破骨細胞的生成發(fā)揮對CIA的保護作用nTregs可以抑制破骨細胞的生成，而破骨細胞的生成過多是造成關節(jié)炎骨質(zhì)破壞的主要因素；由此，我們將探究iTregs是否也通過抑制破骨細胞的生成而發(fā)揮對關節(jié)炎的保護作用。
　　 分離自正常DBA1/J小鼠

21、骨髓的CD11c+細胞即破骨細胞前前體細胞(Osteoclast Precursors，OCPs)，以RANKL和M-CSF共同誘導破骨細胞的生成；同時在培養(yǎng)液中分別加入CD4+CD25-細胞、nTregs、Tcon和iTregs，抗酒石酸磷酸酶(Tartrate-risistant acid phosphatase，TRAP)染色，觀察各種細胞對破骨細胞生成的影響。
　　 nTregs、iTregs分別在免疫后14天注射入關節(jié)

22、炎小鼠體內(nèi)，觀察期(56天)后，病變關節(jié)行CT掃描，觀察關節(jié)骨質(zhì)侵蝕、破壞的發(fā)生與不同。
　　 4.1 TGF-β誘導的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞在體外對破骨細胞生成的抑制作用實驗結果顯示，與基線值(baseline)、CD4+CD25-細胞組和Tcon組相比，nTregs和iTregs均可顯著抑制破骨細胞的生成；減少加入的iTregs比例，破骨細胞的生成有所增加，但與Tcon相比，破骨細胞的生成仍受到顯著抑制。

23、提示iTregs對破骨細胞生成的抑制為劑量相關性的。
　　 4.2 TGF-β誘導的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞在體內(nèi)對骨質(zhì)侵蝕和破壞的抑制作用CT掃描結果顯示，CIA模型組小鼠的關節(jié)呈慢性多關節(jié)炎的表現(xiàn)，關節(jié)表面骨質(zhì)侵蝕明顯，關節(jié)腔融合，關節(jié)強直，骨量減少；而iTregs僅表現(xiàn)為一側關節(jié)的輕度關節(jié)腔狹窄，無骨質(zhì)侵蝕的發(fā)生，關節(jié)腔間隙和骨量與正常的小鼠關節(jié)無異。
　　 5 TGF-β誘導的CD4+CD25+

24、Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞抑制破骨細胞生成的機制研究實驗設立OCPs陽性對照組，和iTregs組，在iTregs與OCPs共培養(yǎng)組中分別加入同型對照(cIgG)組、抗TGF-β單抗組和抗IL-10R抗體組，觀察iTregs是否通過TGF-β和IL-10信號途徑發(fā)揮對破骨細胞生成的抑制作用；同時設立雙層細胞培養(yǎng)板實驗，觀察iTregs對破骨細胞的抑制是否為細胞接觸所依賴的；另外設立OCPs組、Tcon組和iTregs組，收集細胞，提取總蛋白

25、，Western Blotting檢測各組NF-κB亞單位P65和P50的表達水平，明確iTregs是否通過NF-κB途徑發(fā)揮其抑制作用。
　　 5.1 TGF-β誘導的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞對破骨細胞生成的抑制為細胞接觸而非細胞因子接觸所依賴的實驗結果顯示，在加入了抗TGF-β和IL-10R中和抗體后，并未影響iTregs對破骨細胞生成的影響；但雙層細胞板實驗顯示，iTregs一旦與OCPs分離培養(yǎng)，即無法

26、抑制其分化成破骨細胞，提示，iTregs的抑制作用為細胞接觸所依賴的。
　　 5.2 TGF-β誘導的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞通過NF-κB信號途徑發(fā)揮對破骨細胞生成的抑制實驗結果顯示，iTregs與OCPs共培養(yǎng)組，NF-κB亞單位P65和P50的表達水平顯著低于Tcon組及OCPs陽性對照組。
　　 小結
　　 結合上述實驗結果，iTregs在免疫缺陷和正常小鼠體內(nèi)環(huán)境下，都具有很好的穩(wěn)定性

27、，與nTregs相似；但在已發(fā)病的關節(jié)炎小鼠的炎性體內(nèi)環(huán)境下，nTregs易于凋亡并向Th17細胞轉化，同時還喪失了其對T淋巴細胞的抑制力；與之相反的是，iTregs能穩(wěn)定存在，并維持了其對T淋巴細胞的抑制功能。此外，iTregs對CIA小鼠關節(jié)的保護作用，一定程度上得益于其對破骨細胞生成的抑制作用，從而減少了破骨細胞引起的骨質(zhì)侵蝕和破壞；iTregs對破骨細胞的抑制為細胞接觸和NF-κB信號途徑所依賴的，并且表現(xiàn)為iTregs劑量相關

28、性的。綜合以上研究，所得結論如下：
　　 1.在體外，iTregs具有與nTregs相似的Foxp3的表達和對效應性T淋巴細胞的抑制能力。
　　 2.對CIA小鼠，iTregs具有與nTregs相似的預防發(fā)病和減輕關節(jié)炎嚴重程度的作用。
　　 3.iTregs而非nTregs能保持對已發(fā)病關節(jié)炎小鼠的保護作用。
　　 4.iTregs對已發(fā)病的關節(jié)炎小鼠的治療作用的可能機制如下：
　　 1).在體

29、外促炎癥因子IL-6存在的情況下，iTregs仍可保持其抑制力，而nTregs則喪失了大部分的抑制力。
　　 2).在體外，iTregs而非nTregs可以抑制Th17細胞的分化。
　　 3).在免疫缺陷和正常體內(nèi)環(huán)境下，nTregs和iTregs具有相似的穩(wěn)定性。
　　 4).在炎性環(huán)境下，iTregs而非nTregs穩(wěn)定存在，且能顯著降低促炎癥因子IL-17A的水平。
　　 5).iTregs通過抑制