利用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞評(píng)價(jià)肥厚型心肌病心臟停搏液的臨床選擇.pdf

1、目的:肥厚型心肌病(Hypertrophic cardiomyopathy，HCM)是最常見的心臟遺傳性疾病，是一種常染色體顯性遺傳疾病，外科手術(shù)治療是HCM最有效的治療方法之一。目前發(fā)現(xiàn)超過1000個(gè)突變位點(diǎn)與肥厚型心肌病的發(fā)病相關(guān)，這些基因突變?nèi)绾螌?dǎo)致肥厚型心肌病發(fā)病的機(jī)制尚不明確。多能誘導(dǎo)干細(xì)胞(Induced pluripotentstem cell，iPSC)技術(shù)是一種新型的細(xì)胞培養(yǎng)分化技術(shù)，可以將選定基因背景的細(xì)胞誘導(dǎo)逆分化

2、成為多能干細(xì)胞。利用iPS細(xì)胞技術(shù)將肥厚型心肌病患者的皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞，結(jié)合干細(xì)胞向心肌分化的技術(shù)，能夠在細(xì)胞水平探索突變基因在心肌肥厚發(fā)病過程中的作用。同時(shí)利用這種特殊的肥厚型心肌病基因背景的心肌細(xì)胞在體外進(jìn)行藥物篩選，探索適合肥厚型心肌病病理生理特點(diǎn)的心臟外科手術(shù)中使用的停搏液。
　　方法:前期收集了23例接受手術(shù)治療的肥厚型心肌病患者的皮膚組織標(biāo)本，經(jīng)過外顯子測(cè)序，發(fā)現(xiàn)4種已知突變，其中位于MYH7基因的Arg66

3、3His突變有2例患者。取這2例患者的皮膚細(xì)胞制作“基因突變組”iPS細(xì)胞，取同性別健康志愿者制作對(duì)照組iPS細(xì)胞。同時(shí)利用CRISPR/Cas9技術(shù)定點(diǎn)切割修復(fù)“基因突變組”iPS細(xì)胞的突變位點(diǎn)成為正常的基因型，做為“基因修復(fù)組”iPS細(xì)胞。使用小分子單層細(xì)胞分化法將各組iPS細(xì)胞向心肌細(xì)胞定向分化，檢測(cè)各組心肌細(xì)胞分化結(jié)果，以及心肌細(xì)胞搏動(dòng)功能和鈣離子調(diào)控功能的差異。最后，在缺氧倉(cāng)中模擬臨床手術(shù)的缺血再灌注過程，通過凋亡檢測(cè)和鈣離子

4、調(diào)控的檢測(cè)來評(píng)價(jià)3種心臟停搏液:4∶1含血停搏液，HTK停搏液，St.Thomas改良停搏液對(duì)肥厚型心肌病iPS心肌細(xì)胞的保護(hù)差別。
　　結(jié)果:3組基因型的iPS細(xì)胞均高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物OCT4，NANOG，SOX2，SSEA4等，同時(shí)核型均正常，且具有三胚層分化能力。3組種iPS細(xì)胞能夠高陽性率的定向分化心肌細(xì)胞，其中基因突變組的心肌細(xì)胞體積較大，肌纖維增多，肌節(jié)排列紊亂。檢測(cè)鈣離子調(diào)控能力發(fā)現(xiàn)相比較對(duì)照組和基因修復(fù)組，基因突變

5、組心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程增長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)靜息狀態(tài)鈣離子水平增高，異常鈣瞬變發(fā)生率增多。在經(jīng)過缺血再灌注細(xì)胞模型后，在低鈉微鈣的HTK液保護(hù)下的基因突變組心肌細(xì)胞氧自由基水平較4∶1含血停搏液組和Thomas液組降低，同時(shí)鈣離子調(diào)控也較其他兩組改善，所引起的心律失常事件降低，凋亡減少。
　　結(jié)論:本研究建立了肥厚型心肌病患者來源的Arg663His突變的iPS細(xì)胞系，健康對(duì)照的iPS細(xì)胞系和修復(fù)突變位點(diǎn)的基因修復(fù)組iPS細(xì)胞系。利用突變i