大黃復方及其有效成分治療慢性腎衰竭的臨床和機理研究.pdf

1、第一部分：大黃治療慢性腎衰竭的循證醫(yī)學證據(jù)
　　目的:評價大黃治療慢性腎衰竭的有效性及安全性。
　　方法:計算機檢索中國生物醫(yī)學文獻數(shù)據(jù)庫CBM、中國期刊全文數(shù)據(jù)庫CNKI、維普期刊數(shù)據(jù)庫VIP、萬方資源數(shù)據(jù)庫、EMBASE、MEDLINE、PUBMED、Cochrane圖書館中關于大黃治療慢性腎衰竭的隨機和半隨機對照試驗，同時手工檢索相關期刊雜志，并由兩位研究者進行獨立篩選和資料提取，按照改良Jadad評分量表評價所納入的

2、文獻質量，應用Revman5.3軟件進行Meta分析。
　　結果:
　　（一）大黃單方或含大黃的中藥復方口服治療CRF的系統(tǒng)評價
　　納入35篇文獻，共3060例患者，其中治療組1657例，對照組1403例。Meta分析結果顯示，與對照組相比，大黃單方或含大黃的中藥復方口服治療能降低CRF患者Scr[MD=-73.28，95％CI（-85.96，-60.60）];降低BUN[MD=-2.47，95％CI（-3.13，-

3、1.82）];升高CRF患者Ccr[MD=6.66，95％CI(2.93，10.40)];升高Hb[MD=9.31，95％CI(3.81，14.80)];升高Alb[MD=2.94，95％CI(1.75，4.13)];降低24 h尿蛋白定量(24 h UTP)[MD=-0.63，95％CI（-0.95，-0.30）];降低TG[MD=-0.53，95％CI（-0.73，-0.32）]和TC[MD=-1.01，95％CI(-1.44,-0

4、.58)];并且可以改善CRF患者癥狀和體征的總有效率[Peto OR=3.42，95％CI(2.84，4.12)];但對于減少ESRD的發(fā)生[Peto OR=0.57，95％CI為(0.19，1.75)]與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。
　?。ǘ┖簏S的中藥灌腸方治療CRF的系統(tǒng)評價
　　納入28篇文獻，共2278例患者，其中治療組1220例，對照組1058例。Meta分析結果顯示，與對照組相比，含大黃的中藥灌腸方治療能

5、降低CRF患者Scr[MD=-59.62,95％CI（-88.58,-30.67）];降低BUN[MD=-3.27,95％CI（-4.49，-2.05）];升高CRF患者Ccr[MD=3.95，95％CI（-0.03，7.93）];改善CRF患者癥狀和體征的總有效率[Peto OR=4.08，95％CI(3.25，5.12)];并且可以改善中醫(yī)主要證候納差[MD=-0.48，95％CI（-0.77，-0.19）]和惡心嘔吐[MD=-0.

6、65，95％CI（-0.78，-0.52）];但對于升高Hb[MD=6.85，95％CI（-1.82，15.52）]、降低尿酸(UA)[MD=-46.84，95％CI（-102.91，9.22）]與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。
　　結論:與對照組相比，大黃單方或含大黃的中藥復方口服和含大黃的中藥灌腸方均能明顯降低CRF患者Scr、BUN，升高Ccr，同時還能改善患者癥狀和體征的總有效率，大黃單方或含大黃的中藥復方口服能升高Hb、

7、Alb，降低24h UTP、TG和TC，但無證據(jù)顯示在減少ESRD的發(fā)生方面較對照組更為有效;另外，含大黃的中藥灌腸方能改善中醫(yī)主要證候納差和惡心嘔吐，但對于升高Hb和降低UA無證據(jù)顯示較對照組更為有效，表明大黃可能是一種相對安全和有效治療CRF的藥物。但由于所納入的文獻存在研究方法學質量低下的問題，因此進一步進行高質量文獻研究，對評價其療效及安全性十分必要。
　　第二部分：大黃素通過自噬途徑對腎小管損傷的保護機制研究
　　

8、背景及目的：
　　腎毒性的藥物所致的急性腎功能衰竭早已成為臨床醫(yī)生關注的重點，順鉑是一種臨床常用于治療多種惡性腫瘤的廣譜、有效的化療藥物，然而，據(jù)統(tǒng)計，臨床上運用順鉑化療后，導致的腎損害發(fā)生率為25％-35％，且順鉑用藥劑量與其引起的腎臟毒性成一定的比例關系，已成為限制其用量及擴大其應用范圍的主要考慮因素。西藥在治療腎毒性藥物所致腎損傷的同時會帶來過多的不良反應，因此，研究人員致力于尋找一種既能降低順鉑腎毒性，又能保留其抗癌活性的

9、中藥。自噬（autophagy），即溶酶體依賴性的大分子蛋白質和細胞器的自我降解，通過清除衰老的細胞器和長壽命蛋白質，為細胞修復提供原料與營養(yǎng)，實現(xiàn)細胞器更新。細胞凋亡，是機體為了保持恒定的細胞數(shù)目而采取的由基因調控、生物自主的程序化方式。腎毒性的藥物損傷腎小管主要表現(xiàn)為腎小管上皮細胞的凋亡，越來越多的實驗研究報道，在順鉑導致的腎臟細胞凋亡過程中，自噬發(fā)生在凋亡之前，其可能成為其抗凋亡的機制。
　　大黃素是中藥大黃的主要的藥效成分

10、，大量的研究表明其具有保護腎臟的作用，主要集中在抗炎，抑制增殖，抑制細胞表型轉化，以及抗氧化等方面。已有研究報道大黃素能改善順鉑相關性腎毒性，然而，目前還沒有研究報道大黃素是否可以通過自噬途徑改善順鉑引起的腎損傷。但有研究報道，大黃素是一種有效的單磷酸腺苷(AMP)激活蛋白激酶(AMPK)活化劑，并且可以調節(jié)哺乳動物的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑。由于AMPK/mTOR信號通路在細胞自噬的調節(jié)中起著重要的作用，因此，我們推測，在順鉑腎

11、損傷中，大黃素是否有可能通過調節(jié)自噬而起到腎保護作用。
　　我們選用NRK-52E細胞作為研究對象，借助順鉑誘導的NRK-52E細胞損傷模型，通過體外實驗研究，觀察大黃素對順鉑環(huán)境下細胞自噬相關蛋白的變化、自噬體形成情況，以及自噬相關信號通路的影響，進一步探討自噬在腎毒性藥物所致的腎損傷中的變化和大黃素的干預作用，試圖在體外闡明大黃素通過調節(jié)自噬相關信號通路，改善腎毒性藥物所致的腎損傷的分子機制，為大黃素的臨床應用提供新的途徑。<

12、br>　　方法：
　　首先，我們觀察了順鉑處理的NRK-52E細胞形態(tài)和細胞凋亡相關的標志物表達情況。然后用順鉑加或不加大黃素處理NRK-52E細胞，用顯微進行觀察，并且采用免疫印跡(Western Blot，WB)方法，檢測細胞凋亡相關蛋白Caspase-3、cleavedCaspase-3和哺乳動物同源的自噬標記蛋白-微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)Ⅰ/Ⅱ表達的情況，以及采用pmRFP-LC3轉染技術，利用熒光顯微鏡觀察了大黃素

13、處理細胞后自噬顆粒在細胞內的表達和分布情況。
　　其次，我們也應用自噬體-溶酶體結合的抑制劑巴弗洛霉素A1，觀察其加入前后對大黃素誘導的自噬的影響。此外，雷帕霉素，哺乳動物的雷帕霉素mTOR靶蛋白的抑制劑，在應激條件下可以通過抑制mTOR活性而激活自噬，我們利用免疫印跡，顯微鏡觀察和流式細胞儀檢測等方法觀察了順鉑和雷帕霉素處理的細胞形態(tài)變化和細胞凋亡情況。
　　再次，進一步觀察了大黃素通過調節(jié)AMPK/mTOR信號通路對自噬

14、活化的影響。采用WB的方法檢測了大黃素處理細胞后AMPK/mTOR信號通路相關蛋白的表達情況，與此同時，我們也在大黃素處理的細胞中加或不加compound C，一個公認的AMPK抑制劑，觀察NRK-52E細胞形態(tài)和凋亡相關蛋白的表達。
　　最后，除了上述通路的研究外，我們還觀察了MAPKs家族，包括ERK、P38和JNK所介導的信號通路，是否也參與了大黃素誘導的自噬活化。采用WB方法，檢測了大黃素不同時間點處理細胞后p-ERK、p

15、-P38和p-JNK蛋白的表達情況，以及LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表達情況。同時，我們還分別選用了ERK和p38的抑制劑PD098059和SB203580，用大黃素加或不加PD098059和SB203580處理細胞，觀察p-ERK蛋白、p-p38蛋白的表達情況。
　　結果：
　　(1)隨著順鉑用藥時間和劑量的增加，觀察到細胞出現(xiàn)凋亡，WB結果顯示，早期自噬標志性蛋白LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表達增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值

16、增加，晚期凋亡相關蛋白cleaved Caspase-3的表達增加，CCK-8法和流式細胞儀檢測結果與WB的結果一致，晚期凋亡增加。
　　(2)順鉑處理組存活細胞數(shù)目減少，經大黃素干預后，存活細胞數(shù)目明顯增多。免疫印跡處理后，表明大黃素與順鉑共同處理細胞，能夠明顯逆轉單獨順鉑處理細胞所致的cleaved Caspase-3蛋白的上調。同時，大黃素處理細胞，能夠明顯增加LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值和自噬顆粒RFP-LC3點狀結構的表達。我們

17、選用雷帕霉素處理細胞，同樣觀察到其可以增加LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表達，增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值，倒置顯微鏡下觀察到在順鉑和大黃素共同處理細胞時加入巴佛洛霉素A1，凋亡細胞數(shù)反而明顯增加。此外，大黃素還能以時間依賴性的方式下調p-p70S6K蛋白和p-mTOR蛋白的表達，同時上調p-AMPK蛋白的表達。WB結果表明，AMPK的抑制劑compound C能夠明顯的抑制大黃素誘導的AMPK的磷酸化，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化也被明

18、顯的抑制，熒光顯微鏡觀察的結果與WB結果相同，加入了compound C之后，大黃素誘導的紅色熒光自噬顆粒明顯減少。倒置顯微鏡下觀察也發(fā)現(xiàn)compound C能明顯的抑制大黃素的抗凋亡作用，WB結果同樣表明，大黃素能明顯下調順鉑誘導的cleaved Caspase-3蛋白的表達，但當加入compound C共處理之后，又上調了cleaved Caspase-3蛋白的表達。
　　(3) WB處理結果表明，大黃素處理細胞，p-ERK、

19、p-P38和p-JNK蛋白的表達水平隨著時間的變化先增加后降低;當加入ERK的抑制劑PD098059和p38的抑制劑SB203580后，大黃素引起的p-ERK蛋白、p-p38蛋白的增加被抑制。
　　結論：
　　我們的研究結果發(fā)現(xiàn)順鉑處理NRK-52E細胞早期可以出現(xiàn)自噬，晚期則出現(xiàn)凋亡。大黃素能誘導自噬，進而達到改善順鉑導致的NRK-52E細胞凋亡的作用。我們的機制研究結果提示，AMPK/mTOR信號通路和MAPKs家族成員

20、介導的信號通路可能參與了大黃素誘導自噬的過程。
　　第三部分：“益腎清利、和絡泄?jié)岱訙p大黃”辨證方延緩慢性腎衰竭進展的臨床療效觀察
　　目的:評價“益腎清利、和絡泄?jié)岱訙p大黃”辨證方延緩CRF患者腎功能進展的有效性。
　　方法:采用回顧性的研究方法，選擇2013年9月-2015年9月就診于江蘇省中醫(yī)院腎內科導師孫偉教授門診，診斷為慢性腎衰竭的51例患者，觀察“益腎清利、和絡泄?jié)岱訙p大黃”辨證方治療后，臨床癥狀和療

21、效指標的變化，總療程為2年，其中每位患者大黃連續(xù)或間斷用藥療程≥1個月。
　　結果:51例患者經“益腎清利、和絡泄?jié)岱訙p大黃”辨證方治療24個月后，中醫(yī)臨床癥狀積分較初診時相比顯著下降(P＜0.01)。經治療患者的主要療效指標Scr、BUN、UA較治療前相比，均有所下降，具有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。治療前后相比較，RBC有所上升，具有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，治療后Hb輕微上升，但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);治療