穿心蓮內(nèi)酯對GSIs抵抗型T-ALL的干預(yù)及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)是一種惡性血液系統(tǒng)腫瘤，以不成熟的T淋巴細(xì)胞母細(xì)胞惡性增殖為特點(diǎn)。臨床以聯(lián)合化療為主，但出現(xiàn)復(fù)發(fā)和化療抵抗的幾率較高。而復(fù)發(fā)和化療抵抗的病例預(yù)后往往較差。近年來，γ-分泌酶抑制劑（γ-secretase inhibitors，GSIs）對T-ALL的治療作用備受關(guān)注。緣于GSIs是一類可以抑制NOTCH1激活的小分

2、子化合物，而大量的研究顯示NOTCH1通路的異?；罨赥-ALL中扮演重要角色。但到目前為止GSIs的臨床實(shí)驗(yàn)卻沒有取得突破。原因在于GSIs出現(xiàn)了臨床治療抵抗并且伴有劑量依賴性的胃腸道毒性反應(yīng)。
　　本研究以中藥穿心蓮的主要活性成分穿心蓮內(nèi)酯（Andrographolide）為研究對象。體外選擇GSIs抵抗的T-ALL細(xì)胞系，探究穿心蓮內(nèi)酯克服GSIs抵抗和恢復(fù)GSIs敏感性的作用及機(jī)制。并觀察穿心蓮內(nèi)酯對健康人外周血淋巴細(xì)胞的

3、作用，明確穿心蓮內(nèi)酯的安全性和選擇性。構(gòu)建GSIs抵抗的T-ALL動物模型，證實(shí)穿心蓮內(nèi)酯體內(nèi)克服GSIs抵抗和恢復(fù)GSIs敏感性的作用。同時(shí)觀察穿心蓮內(nèi)酯與GSIs合用對GSIs胃腸道毒性的緩解作用。
　　方法:
　　穿心蓮內(nèi)酯體外克服GSIs抵抗及對健康人外周血淋巴細(xì)胞的影響。MTS法觀察穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物對CRFF-CEM和Jurkat細(xì)胞增殖活力的影響，并計(jì)算EC50值。穿心蓮內(nèi)酯單用及與DAPT(GSI-IX)合

4、用干預(yù)CRFF-CEM和Jurkat細(xì)胞。DAPT是一種新型的GSIs，同樣具有抑制NOTCH1活化的作用。MTS法檢測細(xì)胞增殖活力，細(xì)胞計(jì)數(shù)記錄細(xì)胞增殖曲線。Annexin-Ⅴ/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡。PI染色檢測細(xì)胞周期的變化。分離健康人外周血淋巴細(xì)胞，以2，4，8，16μM的穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)，測定細(xì)胞增殖活力和細(xì)胞凋亡情況。
　　穿心蓮內(nèi)酯對引起GSIs抵抗的關(guān)鍵蛋白及通路的調(diào)控作用。穿心蓮內(nèi)酯單用或與DAPT合用干預(yù)CRFF

5、-CEM和Jurkat細(xì)胞。蛋白免疫印跡檢測經(jīng)NOTCH1胞內(nèi)活化形式NICD以及PI3K/Akt/S6通路中的關(guān)鍵蛋白pAkt和pS6的表達(dá)。蛋白免疫印跡檢測CRFF-CEM和Jurkat細(xì)胞中c-Myc和Mcl-1的蛋白表達(dá)，qRT-PCR相對定量c-Myc和Mcl-1的mRNA表達(dá)。蛋白免疫印跡測定穿心蓮內(nèi)酯對CRFF-CEM和Jurkat細(xì)胞NF-κB通路中的p105/p50，p65，IKKβ和IκBα蛋白表達(dá)的調(diào)控。
　

6、　穿心蓮內(nèi)酯恢復(fù)GSIs敏感性的關(guān)鍵位點(diǎn)。檢測c-Myc抑制劑10058-F4單用及與DAPT合用對CRFF-CEM和Jurkat細(xì)胞增殖活力和凋亡的影響。檢測PI3K抑制劑PI-103單用及與DAPT合用抑制CRFF-CEM和Jurkat細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。檢測10058-F4，PI-103，DAPT三者合用對NICD，c-myc，p-Akt和pS6表達(dá)的影響。觀察10058-F4，PI-103，DAPT三者合用對CRFF-CE

7、M和Jurkat細(xì)胞增殖活力及凋亡的影響。MCL1的shRNA克隆慢病毒侵染Jurkat細(xì)胞，沉默Mcl-1的轉(zhuǎn)錄激活和表達(dá)。檢測DAPT對Mcl-1沉默的Jurkat細(xì)胞的增殖活力和凋亡作用的影響。
　　穿心蓮內(nèi)酯體內(nèi)克服GSIs抵抗及緩解GSIs的胃腸道毒性。BAlB/c裸鼠皮下注射Jurkat細(xì)胞懸液構(gòu)建GSIs抵抗的T-ALL人癌異體移植瘤模型。穿心蓮內(nèi)酯200mg/kg，DAPT25mg/kg，及兩者合用灌胃干預(yù)荷瘤BA

8、lB/c裸鼠20天，記錄腫瘤體積變化并計(jì)算腫瘤抑制率。免疫組化檢測腫瘤組織中Ki-67和Caspase-3表達(dá)變化。蛋白免疫印跡檢測腫瘤組織中NICD，pAkt，p65，c-Myc，pS6及Mcl-1的蛋白表達(dá)。25mg/kgDAPT，100mg/kg DAPT，200mg/kg穿心蓮內(nèi)酯，200mg/kg穿心蓮內(nèi)酯+25mg/kg DAPT灌胃干預(yù)C57BL/6小鼠7天。取C57BL/6小鼠十二指腸，HE染色觀察腸道上皮杯狀細(xì)胞病理變

9、化。
　　結(jié)果:
　　穿心蓮內(nèi)酯對CRFF-CEM和Jurkat均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制細(xì)胞增殖的作用，EC50分別為2.604μM和3.782μM。而內(nèi)酯環(huán)脫去-OH的穿心蓮內(nèi)酯的衍生物則對細(xì)胞活力沒有明顯影響。DAPT對CRFF-CEM和Jurkat的細(xì)胞活力，凋亡及周期均沒有明顯影響。穿心蓮內(nèi)酯對DAPT抵抗的CRFF-CEM和Jurkat的細(xì)胞具有抑制細(xì)胞增殖活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期的作用。而與DAPT合用后抑制增

10、殖，誘導(dǎo)凋亡和阻滯周期的作用增強(qiáng)。穿心蓮內(nèi)酯不引起明顯的健康人外周血淋巴細(xì)胞的凋亡，且具有一定的促進(jìn)增殖的作用。
　　穿心蓮內(nèi)酯對NICD也具有一定的抑制作用。而且可以下調(diào)超活化的PI3K/Akt通路中關(guān)鍵蛋白pAkt和pS6的表達(dá)。穿心蓮內(nèi)酯下調(diào)FBXW7突變所致的c-Myc和Mcl-1過表達(dá)，同時(shí)抑制MYC和MCL1的轉(zhuǎn)錄激活。穿心蓮內(nèi)酯還能夠重新激活DAPT對c-Myc的抑制作用。穿心蓮內(nèi)酯抑制NF-κB通路的激活。相對p1

11、05/p50，主要下調(diào)p65的表達(dá)。還能夠抑制上游激活型號IKKβ的表達(dá)，但是卻沒有提高掩蓋NF-κB的核定位信號的IκBα的表達(dá)。
　　c-Myc抑制劑10058-F4和PI3K抑制劑PI-103均可以抑制CRFF-CEM和Jurkat細(xì)胞的增殖。但是并沒有恢復(fù)DAPT抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。10058-F4，PI-103和DAPT三者合用對PI3K/Akt/S6通路，c-Myc和NICD均具有較強(qiáng)的抑制作用。10058-F

12、4和PI-103兩者合用相較各自單用抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用更強(qiáng)。但是10058-F4，PI-103和DAPT三者合用恢復(fù)DAPT抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用仍然有限。DAPT對MCL1被沉默的Jurkat細(xì)胞表現(xiàn)出一定的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。
　　穿心蓮內(nèi)酯抑制了BAlB/c裸鼠的Jurkat細(xì)胞皮下移植瘤的生長。DAPT沒有表現(xiàn)出抑制腫瘤生長的作用。但是穿心蓮內(nèi)酯和DAPT合用后抑制腫瘤生長的作用更明顯。穿心蓮內(nèi)酯抑制

13、腫瘤組織中反應(yīng)細(xì)胞增殖活躍程度的Ki-67的表達(dá)而增強(qiáng)凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)。穿心蓮內(nèi)酯和DAPT聯(lián)合干預(yù)對Ki-67的抑制作用和Caspase-3的上調(diào)作用更強(qiáng)。DAPT體內(nèi)依然具有對NICD較強(qiáng)的抑制作用。穿心蓮內(nèi)酯和DAPT合用在體內(nèi)也保持了對NICD，pAkt，p65，c-Myc，pS6和Mcl-1的表達(dá)的抑制作用，與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。100mg/kg DAPT灌胃7天引起C57BL/6小鼠十二指腸上皮細(xì)胞出現(xiàn)明

14、顯杯狀細(xì)胞化生。而降低劑量以25mg/kg的DAPT灌胃C57BL/6小鼠7天，小鼠十二指腸未出現(xiàn)明顯的病理變化。同樣，200mg/kg穿心蓮內(nèi)酯和25mg/kgDAPT聯(lián)用也沒有引起C57BL/6小鼠十二指腸的明顯病理改變。
　　結(jié)論:
　　穿心蓮內(nèi)酯抑制GSIs抵抗的細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，阻滯分裂周期。并且能夠一定程度恢復(fù)DAPT的敏感性。內(nèi)酯環(huán)上的-OH對穿心蓮內(nèi)酯活性的保持非常重要。穿心蓮內(nèi)酯不引起健康人外周血淋巴細(xì)胞

15、的凋亡，還具有一定的刺激增殖作用。
　　穿心蓮內(nèi)酯本身也具有一定的抑制NOTCH1胞內(nèi)活化的作用。而其對GSIs抵抗的細(xì)胞依然保持較強(qiáng)的抑制作用可能與以下機(jī)制有關(guān)。(1)下調(diào)PTEN缺失或失活引起的PI3K/Akt通路超活化。(2)抑制FBXW7突變導(dǎo)致的c-Myc過表達(dá)，并能夠重新激活DAPT對c-Myc的抑制作用。(3)阻滯由FBXW7突變繼發(fā)的Mcl-1過表達(dá)而引起的凋亡逃逸。(4)抑制NF-κB通路的激活。
　　單純

16、抑制c-Myc和PI3K/Akt通路并不能恢復(fù)DAPT的敏感性。同時(shí)抑制c-Myc和PI3K/Akt通路對DAPT敏感性的恢復(fù)作用也有限。而抑制MCL1的轉(zhuǎn)錄激活和表達(dá)可能是恢復(fù)GSIs敏感性的關(guān)鍵。
　　穿心蓮內(nèi)酯體內(nèi)依然具有抗T-ALL的活性，并且能夠恢復(fù)DAPT在體內(nèi)的活性。穿心蓮內(nèi)酯抑制腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的增殖并誘導(dǎo)凋亡，對與T-ALL發(fā)病密切相關(guān)的蛋白的作用與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。穿心蓮內(nèi)酯和低劑量的DAPT合用能夠緩解DA