基于代謝組學(xué)研究決明子水提物及橙黃決明素對(duì)高脂血癥大鼠代謝的影響.pdf

1、目的:研究基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)的代謝組學(xué)應(yīng)用于決明子水提物及橙黃決明素對(duì)高脂血癥模型大鼠體內(nèi)代謝物的影響。通過(guò)常用的代謝組學(xué)分析方法找到高脂血癥的生物標(biāo)志物，探討決明子及橙黃決明素調(diào)脂作用與高脂血癥生物標(biāo)志物的聯(lián)系。從而為決明子中藥材以及橙黃決明素的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與利用提供有價(jià)值的依據(jù)。
　　方法:(1)大鼠高脂血癥模型的建立
　　將適應(yīng)環(huán)境3d后的Sprague-Dawley雄性大鼠隨機(jī)分成2組，正常對(duì)照組:

2、普通飼料喂養(yǎng);高脂血癥模型組:高脂飼料（蛋黃粉8.0％、豬油6.0％、膽固醇4.0％、膽酸鈉0.5％、丙硫氧嘧啶0.2％及基礎(chǔ)飼料81.3％）喂養(yǎng)。30d后眼底靜脈叢取血檢測(cè)其生化指標(biāo)，確認(rèn)造模效果。
　　(2)建立大鼠血清中內(nèi)源性代謝物GC-MS定量分析方法
　　由于GC-MS能檢測(cè)的成分必須具備揮發(fā)性，所以對(duì)血清樣品進(jìn)行肟化-硅烷化衍生處理，從而達(dá)到能夠檢測(cè)難揮發(fā)和較大極性代謝產(chǎn)物的目的。將多個(gè)樣本均勻混合而制成質(zhì)量控制

3、(quality control，QC)樣本，結(jié)合混合標(biāo)準(zhǔn)品樣本中各標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)含量的RSD值進(jìn)行GC-MS方法學(xué)的考察。
　　(3)高脂血癥生物標(biāo)志物篩選
　　比較高脂血癥造模前后、決明子水提物、橙黃決明素及阿托伐他汀治療前后大鼠體內(nèi)代謝物的變化，采用變量的投影重要性指標(biāo)(VIP)和隨機(jī)森林算法兩種方法尋找與高脂血癥相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，對(duì)尋找到的潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，確認(rèn)最終的生物標(biāo)志物。運(yùn)用主成分分析法(PCA)

4、和偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)得到?jīng)Q明子水提物、橙黃決明素及阿托伐他汀調(diào)脂作用與高脂血癥生物標(biāo)志物的相關(guān)性，從而對(duì)其調(diào)脂作用做出推斷。
　　結(jié)果:(1)除造模過(guò)程中死去的大鼠外，其余大鼠各項(xiàng)生化指標(biāo)均有變化，其中低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05），提示高脂血癥大鼠造模成功。
　　(2)QC樣本的大部分代謝物RSD值及混合標(biāo)準(zhǔn)品樣本中各標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)含量的RSD值均小于20％，說(shuō)明樣本前處理重復(fù)性

5、好，儀器穩(wěn)定性亦良好，獲得的數(shù)據(jù)可靠，可以用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。結(jié)合化學(xué)對(duì)照品、NIST05及NIST107質(zhì)譜庫(kù)對(duì)大鼠血清內(nèi)源性代謝物進(jìn)行定性，準(zhǔn)確定性出共45個(gè)代謝物，其中的27個(gè)用化學(xué)對(duì)照品定性，另外18個(gè)在NIST107和NIST05質(zhì)譜庫(kù)中檢索，其相似度均≥85％。這45種代謝物中包含有機(jī)酸、脂肪酸、氨基酸、糖類以及膽固醇。
　　(3)采用VIP值得到了9種與高脂血癥相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物:L-纈氨酸、丙氨酸、甘氨酸、富馬酸

6、、異亮氨酸、絲氨酸、硬脂酸、亞油酸和膽固醇;采用隨機(jī)森林算法得到與高脂血癥相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物10個(gè)，分別為丙氨酸、甘氨酸、L-纈氨酸、異亮氨酸、富馬酸、絲氨酸、1，5-脫水山梨醇、亞油酸、硬脂酸和膽固醇。對(duì)這些生物標(biāo)志物進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，最終得到5種具有差異的代謝物:丙氨酸、L-纈氨酸、異亮氨酸、亞油酸和膽固醇。以此5種代謝物建立PLS-DA模型，具有良好的分離度。因此認(rèn)為此5種代謝物為高脂血癥相關(guān)的生物標(biāo)志物。
　　結(jié)論:(1)

7、GC-MS用于代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集時(shí)存在一定的缺陷，但在對(duì)血清樣本采取肟化-硅烷化衍生處理后，可以作為一種準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性良好的數(shù)據(jù)采集方法，更好地應(yīng)用于代謝組學(xué)的研究。
　　(2)本實(shí)驗(yàn)通過(guò)2種不同代謝組學(xué)分析方法尋找與高脂血癥相關(guān)的生物標(biāo)志物，結(jié)合t檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行PLS-DA建模，最終得到5種高脂血癥的潛在生物標(biāo)志物。通過(guò)PCA、PLS-DA比較分析了決明子水提物和橙黃決明素治療前后高脂血癥大鼠體內(nèi)代謝物的變化情況，發(fā)現(xiàn)橙黃決明素具有