基于TLRs-MyD88與NLRP3通路的桂枝芍藥知母湯治療大鼠痛風性關(guān)節(jié)炎的作用機制研究.pdf

1、目的：在探討桂枝芍藥知母湯（Guizhishaoyaozhimu Decoction,GD）治療痛風性關(guān)節(jié)炎（Gouty Arthritis，GA）相關(guān)理論基礎上，基于TLRs-MyD88及NLRP3炎性體( NACHT-LRR-PYD-containing proteins3 inflammasome)信號通路，以GA相關(guān)的受體、信號銜接蛋白、炎性因子為觀察指標，用三個實驗觀察GD對尿酸鈉踝關(guān)節(jié)注射致GA模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織及尿酸鈉混

2、懸液誘導的大鼠中性粒細胞、巨噬細胞炎性信號表達的影響，以期探明GD治療GA的抗炎作用機制。
　　方法：實驗一采用尿酸鈉踝關(guān)節(jié)注射致GA大鼠模型方法，對比觀察秋水仙堿及GD給藥組對模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中炎性信號因子TLR-2、TLR-4、NLRP3、MyD88、ASC、Capase-1、Capase-12、IKK-β、IκB-α、PPAR-γ、IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10、COX-2、TGF-β1、NF-κ

3、B表達的影響，實驗二、三采用細胞藥理學方法，對比觀察秋水仙堿及GD給藥組對尿酸鈉混懸液誘導的大鼠中性粒細胞、巨噬細胞炎性信號TLR-2、TLR-4、NLRP3、MyD88、ASC、Capase-12、IKK-β、IκB-α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、S100A8、NF-κB表達的影響。主要觀察指標及檢測方法如下：
　?、艑嶒炓?80只雄性SD大鼠隨機分配到3個實驗，即關(guān)節(jié)滑膜IHC實驗、ELISA實驗、Westb

4、lot實驗。各試驗取大鼠60只，按體重隨機分為6組，每組10只，即模型對照組、正常對照組、GD中、高、低劑量組（4，8，16 g?kg-1）、秋水仙堿陽性對照組（3×10-4g?kg-1）。實驗組均灌胃給藥，正常與模型組給予等量蒸餾水，每天1次，連續(xù)7天。第5天灌胃前，大鼠足踝關(guān)節(jié)注射尿酸鈉懸液誘導GA。取大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織，IHC技術(shù)檢測受體TLR-2、TLR-4、NLRP3的表達，Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)測定平均

5、 IOD， WesternBlot法檢測 MyD88、ASC、Capase-1、Capase-12、IKK-β、IκB-α、PPAR-γ信號蛋白表達水平。酶聯(lián)免疫吸附實驗法（ELISA）測定炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10、COX-2、TGF-β1表達水平,DPI-ELISA方法檢測NF-κB活性。
　?、茖嶒灦?、三大鼠30只，按體重隨機分為5組，每組6只， GD中、高、低劑量組（4，8，16 g?k

6、g-1）、秋水仙堿陽性對照組（3×10-4g?kg-1）均灌胃給藥，正常組給予等容積的蒸餾水，每天1次，連續(xù)給藥7天。最后一次灌胃1 h后，所有大鼠乙醚麻醉，取血清備用。SD雄性大鼠各20只，參照文獻方法提取分離大鼠中性粒細胞與巨噬細胞，接種培養(yǎng)。細胞試驗分為2個實驗組（不加受體抑制劑，加NLRP3受體抑制劑），每個實驗組均含6個組，正常對照組加入正常大鼠血清，模型對照組、中、高、低劑量組、秋水仙堿組全部滴加200μg〃L-1的尿酸鈉混

7、懸液造模，同時滴加含藥血清，臵于CO2細胞培養(yǎng)箱中，中性粒細胞孵育12 h取出，巨噬細胞孵育2 h取出。ELISA法測定炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、S100A8的表達，DPI-ELISA方法檢測NF-κB活性； WesternBlot法檢測MyD88、ASC、Capase-12、IKK-β、IκB-α信號銜接蛋白表達水平；RT-PCR法觀測TLR-2、TLR-4、NLRP3 mRNA的表達。
　　結(jié)果：

8、r>　　⑴實驗一造模72h后，大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLRs-MyD88信號通路相關(guān)因子表達結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中 TLR-2、TLR-4平均IOD值、MyD88、IKK-β、IL-2、COX-2、IL-10、NF-κB蛋白表達水平明顯升高(P＜0.05)；IκB-α、PPAR-γ、TGF-β1表達明顯降低(P＜0.05)；與模型組比較，秋水仙堿組、GD中、高劑量(8，16 g〃kg－1)組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR-2

9、、TLR-4平均IOD值、MyD88、IL-2、COX-2、IL-10、NF-κB表達水平顯著降低(P＜0.05)；GD中、高劑量組IκB-α、PPAR-γ、TGF-β1表達明顯升高(P＜0.05)，GD各劑量組IKK-β無明顯變化。GD中、高劑量組對MyD88表達抑制作用明顯，秋水仙堿組比較有顯著差異(P＜0.05)。
　　大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中NLRP3炎性體信號通路相關(guān)因子表達結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中NLRP

10、3、ASC、Capase-1、IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB表達明顯升高(P＜0.05)，Capase-12表達明顯降低(P＜0.05)；與模型組比較，秋水仙堿組、GD中、高劑量組NLRP3、ASC、GD各劑量組Capase-1、IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB表達水平均顯著降低(P＜0.05)，GD中、高劑量組Capase-12表達明顯升高(P＜0.05)。GD中、高劑量組對Capase-12、TGF-β1表

11、達上調(diào)作用明顯高于秋水仙堿組(P＜0.05)。
　?、茖嶒灦行粤＜毎跤?2 h后，細胞中TLRs-MyD88信號通路相關(guān)因子表達結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠中性粒細胞中TLR-2、TLR-4 mRNA、MyD88、IKK-β、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、S100A8、NF-κB的表達水平明顯升高(P<0.05)；IκB-α表達水平明顯降低(P<0.05)；不加受體抑制劑實驗中，與模型組比較，秋水仙堿組及GD各

12、劑量組TLR-2、TLR-4 mRNA、MyD88、IKK-β、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、GD高劑量組NF-κB及秋水仙堿組S100A8表達均明顯降低( P<0.05)，GD高劑量組IκB-α、S100A8表達明顯升高(P<0.05)。TLR受體抑制劑明顯抑制了中性粒細胞的TLR-2、TLR-4 mRNA、IKK-β、IκB-α、IL-1β、IL-6、IL-8、NF-κB的表達。GD各劑量組中S100A8、IκB-α表

13、達量顯著高于秋水仙堿組(P＜0.05)。
　　中性粒細胞中NLRP3炎性體信號通路相關(guān)因子表達結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠中性粒細胞NLRP3 mRNA、ASC(不加NLRP3受體抑制劑組)、IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB表達水平明顯升高(P<0.05)，Caspase-12表達水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，給藥各組NLRP3 mRNA、IL-1β、IL-6、TNF-α及秋水仙堿組、GD高劑量組ASC

14、、GD中、高劑量組NF-κB表達均明顯降低(P<0.05)，GD中、高劑量組Caspase-12表達明顯升高(P<0.05)，而秋水仙堿組Caspase-12表達無明顯變化；NLRP3受體抑制劑明顯減少了中性粒細胞NLRP3 mRNA,IL-1βIL-6、TNF-α的表達，但對NF-κB無明顯影響。GD中、高劑量組Caspase-12表達明顯升高，與秋水仙堿組比較有顯著差異(P＜0.05)。
　?、菍嶒炄奘杉毎跤? h后，細胞

15、中TLRs-MyD88信號通路相關(guān)因子表達結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠巨噬細胞中TLR-2、TLR-4 mRNA、MyD88、IKK-β、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、S100A8、NF-κB表達水平明顯升高(P<0.05)；，IκB-α表達水平明顯降低(P<0.05)；不加受體抑制劑實驗中，與模型組比較，給藥各組TLR-2、TLR-4 mRNA、MyD88、IKK-β及 GD高劑量組及秋水仙堿組 IL-1β、IL-6、

16、IL-8、TNF-α、NF-κB的表達均明顯降低( P<0.05)，GD高劑量組IκB-α、S100A8、TGF-β1表達明顯升高(P<0.05)。TLR受體抑制劑明顯減少了巨噬細胞中TLR-2、TLR-4 mRNA、IκB-α、IL-1β、IL-8、TGF-β1的表達。GD各劑量組中S100A8、IκB-α表達量顯著高于秋水仙堿組(P＜0.05)
　　巨噬細胞中NLRP3炎性體信號通路相關(guān)因子表達結(jié)果：細胞造模2 h后，與正常組

17、比較，模型組大鼠巨噬細胞中NLRP3 mRNA、ASC、IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB表達水平明顯升高(P<0.05)；Caspase-12表達水平明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，給藥各組NLRP3 mRNA、TNF-α及GD高劑量組ASC、IL-1β、IL-6、NF-κB表達均明顯降低(P<0.05)，GD中、高劑量組Caspase-12表達明顯升高(P<0.05)，且與秋水仙堿組比較有顯著差異(P＜0.05)。

18、NLRP3受體抑制劑明顯抑制了巨噬細胞 NLRP3 mRNA、ASC、Caspase-12、IL-1β的表達，但對NF-κB活性無明顯影響。
　　結(jié)論：三個實驗結(jié)果一致表明：GD治療 GA的作用機制可能與降低TLR-2、TLR-4、NLRP3受體及 MyD88、ASC蛋白表達，增加 PPAR-γ、IκB-α表達，抑制IL-1β分化成熟及NF-κB活化，降低Toll-MyD88及NLRP3炎性體信號通路炎性因子表達有關(guān)。細胞實驗結(jié)果