桂枝芍藥知母湯抗類風濕性關節(jié)炎的網絡靶標預測及作用機制研究.pdf

1、目的:
　　在中醫(yī)整體觀思想指導下，采用藥物靶標預測、網絡分析和實驗驗證相結合的方法，探討桂枝芍藥知母湯(GSZD)治療類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)的潛在分子機制，為臨床合理用藥提供理論支撐和實驗依據，也為進一步新藥研發(fā)及同類復方的研究提供方法學參考。
　　方法:
　　1、GSZD所含化學成分的候選靶標預測
　　1.1、從臺灣中醫(yī)藥資料庫TCM Database@Taiwan收

2、集GSZD所含化學成分的二級結構信息。
　　1.2、基于結構相似性原理，利用Therapeutic Targets Database中的Drug similaritysearch工具，獲得與上述復方所含化學成分具有相似化學結構的已知藥物分子（結構相似度標準:similar～very similar, similar score＞0.85），并將其作為GSZD所含化學成分的候選靶標分子。
　　2、GSZD所含中藥-候選靶標-R

3、A相關分子網絡分析
　　2.1、已知抗RA靶標分子的收集和整理
　　在DrugBank數據庫、OMIM數據庫、GAD數據庫和KEGG通路數據庫中進行已知抗RA靶標分子的收集。
　　2.2、蛋白質相互作用信息的收集和整理
　　2.3、GSZD所含中藥-候選靶標分子網絡的建立和分析
　　2.4、GSZD-候選靶標-RA相關分子網絡的建立和分析
　　3、整體實驗
　　3.1、關節(jié)炎模型的建立
　

4、　選用健康雄性Lewis大鼠，6-7周齡，體重180-220g，尾根單次皮內注射0.1ml/只完全弗式佐劑，建立佐劑誘導性關節(jié)炎(Adjuvant-Induced Arthritis，AIA)模型。
　　3.2、動物分組、給藥和取材
　　雄性Lewis大鼠48只，取材時間點為造模后第21天，每組8只隨機分為6個組，組別如下:正常組，AIA組，低、中、高劑量GSZD治療組，甲氨喋呤(MTX)治療組。GSZD三個劑量為4.65，

5、9.30，18.60g/kg（分別相當于臨床0.5倍、1倍、2倍等效劑量），甲氨喋呤劑量0.2mg/kg（相當于臨床等倍劑量）。從造模當天開始給藥，GSZD連續(xù)給藥，甲氨蝶呤每給藥3天，間歇1天。第21天處死動物，取關節(jié)組織固定或放置低溫冰箱備用，分別用于后續(xù)的組織病理學檢測及蛋白印跡反應。
　　3.3、關節(jié)炎評價
　　3.3.1、關節(jié)炎嚴重程度評價
　　及時觀察并記錄各組大鼠臨床紅腫癥狀，采用雙盲法評價疾病的嚴重程度

6、，包括臨床積分、關節(jié)炎發(fā)病率、肢體累計率、首次發(fā)病時間四個指標。臨床積分參照Cheryl L方法即四肢的總分（總分最多80分），踝關節(jié)大于1分或者掌關節(jié)大于1分算發(fā)病;發(fā)病率即發(fā)病數量與本組總數的比值;肢體累計率即發(fā)病肢體數與本組大鼠的總肢體數比值;起始發(fā)病時間即首次觀察到關節(jié)炎臨床癥狀的時間。
　　3.3.2、關節(jié)炎大鼠受損組織的病理變化
　　采用HE染色法和甲苯胺藍染色法對取材后的大鼠受損關節(jié)組織（踝關節(jié)）進行染色，鏡下

7、觀察各組大鼠踝關節(jié)的病理變化，觀察大鼠滑膜炎癥、軟骨損傷及骨破壞情況并采用雙盲法計分。
　　3.3.3、炎癥相關指標的檢測
　　采用western blot方法檢測取材后的大鼠受損踝關節(jié)中HDAC1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB-TNF-α信號軸中五個蛋白質分子的表達情況，并利用軟件進行數據分析。
　　4、體外細胞實驗
　　4.1、細胞培養(yǎng)
　　選用RA患者成纖維滑膜細胞(HFLS-RA)，使用

8、滑膜細胞專用培養(yǎng)基(CellApplications公司，USA)加100U/mL青霉素，80U/mL鏈霉素，2mM谷氨酰胺及10％專用生長因子，在37℃、5％CO2、95％空氣的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，實驗所用細胞均為狀態(tài)良好的第4-8代細胞。
　　4.2、細胞誘導及藥物干預
　　細胞長到約為80％時可用，除正常對照組外，其余組別的細胞均用10ng/mL白介素（IL-1β）誘導24h產生炎性因子。除正常組和誘導對照組外，其他組分別加

9、入不同濃度的GSZD（5.12×10-5，2.56×10-4，1.28×10-3μg/mL）。
　　4.3、炎癥相關指標檢測
　　體外培養(yǎng)的HFLS-RA給予不同干預條件后，采用western blot方法檢測HDAC1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB-TNF-α信號軸中五個蛋白質分子的表達情況，并利用軟件進行統(tǒng)計分析。
　　結果:
　　1、GSZD所含化學成分的候選靶標譜
　　從臺灣中醫(yī)藥資料庫

10、TCM Database@Taiwan收集得到165個GSZD所含化學成分的二級結構，基于結構相似性原理預測得到該復方的77個候選靶標，其中有15個是已知抗RA藥物、自身免疫性疾病治療藥物、以及鎮(zhèn)痛藥物的靶標分子。
　　2、GSZD所含中藥-候選靶標-RA相關分子網絡分析
　　2.1、共收集得到208個已知RA治療靶點;
　　2.2、GSZD所含中藥-候選靶標分子網絡的建立和分析
　　基于GSZD所含中藥及其對應

11、候選靶標分子的相互作用，建立“GSZD所含中藥-候選靶標分子網絡”。通過共模塊化分析，該網絡被劃分為三個模塊，分別以桂枝、芍藥、知母為中心，其中第一個模塊以桂枝為中心，主要參與炎癥反應、細胞因子合成及刺激反應、補體和凝血級聯(lián)反應相關的信號通路有關;第二個模塊以芍藥為中心，主要與藥物代謝和降低藥物毒性有關;第三個模塊以知母為中心，與細胞膜受體介導的信號轉導和G-蛋白信號轉導有關。
　　2.3、GSZD所含中藥-候選靶標-RA相關分子

12、網絡
　　(1)篩選到GSZD候選靶標-已知抗RA靶標相互作用網絡中的135個hub節(jié)點;
　　(2)根據通路富集分析結果顯示，這些hub節(jié)點通過參與T細胞和B細胞受體通路、Toll-like受體通路、破骨細胞分化、NF-kappa B信號通路、TNF信號通路、趨化因子通路、VEGF通路和神經反應性配體和受體相互作用，進而影響到RA進展中的主要病理學改變如炎癥、滑膜血管翳形成、炎細胞浸潤、血管新生、關節(jié)損傷和疼痛;
　

13、　(3)通過網絡拓撲特征值的計算，篩選到40個關鍵hub節(jié)點，其中有10個為GSZD的關鍵候選靶標;
　　(4)通過計算上述網絡中每條邊的邊介度值，發(fā)現HDAC1-HSP90AA1相互作用對的邊介度值最高(edge-betweenness=128.25)，說明該相互作用對在網絡中發(fā)揮重要的媒介作用;
　　(5)發(fā)現有三個已知抗RA靶標（NFKB2、IKBKB和TNF-α）與HDAC1-HSP90AA1發(fā)生直接相互作用，并形成

14、HDAC1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB-TNF-α信號軸;
　　(6)進一步功能挖掘結果顯示，HDAC1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB-TNF-α信號軸主要參與抗原呈遞、T細胞和B細胞受體信號通路、Toll-like受體信號通路、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、破骨細胞分化、NF-kappa B信號通路和TNF信號通路。網絡分析結果提示 GSZD可能通過調控HDAC1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB

15、-TNF-α信號軸來矯正RA病程中失衡的“炎癥-免疫分子網絡”。
　　3、整體實驗驗證
　　3.1、GSZD能緩解AIA大鼠的關節(jié)炎嚴重程度
　　肉眼觀察AIA模型組的大鼠臨床紅腫、畸形癥狀明顯，數據統(tǒng)計表明，AIA模型組的大鼠發(fā)病率為100％，臨床積分最高35分，平均首次發(fā)病時間為造模后第11天，肢體累計率為52％。GSZD給藥后可顯著改善AIA大鼠關節(jié)炎嚴重程度，體現在降低關節(jié)臨床積分、發(fā)病率、肢體累計率，延長首次

16、發(fā)病時間。
　　3.2、GSZD對AIA大鼠關節(jié)組織病理學的改善作用
　　HE染色和甲苯胺藍染色顯示，AIA模型組的大鼠關節(jié)腔內出現炎性細胞浸潤現象，滑膜增生明顯，軟骨損傷和骨損壞明顯。GSZD可降低AIA大鼠關節(jié)炎評分、軟骨破壞評分及骨破壞評分。
　　3.3、GSZD對HDA C1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB-TNF-α信號軸的調控作用
　　western blot方法檢測表明，與正常組相比，AI

17、A模型組的大鼠受損踝關節(jié)組織中HDAC1，HSP90AA1，NFKB2，IKBKB及TNF-α五種蛋白的表達均異常升高，GSZD能有效降低AIA大鼠踝關節(jié)中上述五種蛋白質的表達水平。
　　4、體外細胞實驗驗證
　　western blot方法檢測表明，與空白對照組相比，IL-1β誘導的HFLS-RA中HDAC1，HSP90AA1，NFKB2，IKBKB及TNF-α的蛋白表達均上調，GSZD能有效降低這五種蛋白的表達。

18、　　結論:
　　本研究基于網絡藥理學研究策略，整合藥物靶標預測、網絡分析和實驗驗證的方法，闡釋GSZD治療RA的作用機制。實驗結果表明，GSZD具有改善RA病情、減輕RA癥狀的作用，其作用機制可能是通過調控HDAC1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB-TNF-α信號軸來矯正RA進展中失衡的“炎癥-免疫分子網絡”。此項研究為GSZD在臨床治療RA中的合理運用提供了實驗依據，也為新藥研發(fā)及其他同類中藥復方的研究奠定了方法學基礎