STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型睪丸組織中NGF、VEGF表達(dá)變化.pdf

1、目的：通過(guò)觀察鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型睪丸組織中神經(jīng)生長(zhǎng)因子（Nerve growth factor，NGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)與分布情況的變化，并探究睪丸組織中NGF與VEGF表達(dá)之間的關(guān)系，為治療糖尿病致睪丸功能障礙等疾病提供了理論基礎(chǔ)及新的治療方向。
　　方法：選用清潔級(jí)4周齡健康雄性C57BL/6小

2、鼠50只，體重18～20g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。適應(yīng)性生長(zhǎng)1周，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為A組、B組：A組25只C57BL/6小鼠和B組25只C57BL/6小鼠。將C57BL/6小鼠禁食8小時(shí)后稱取體重，A組按照200mg/Kg的劑量腹腔注射配制好的STZ溶液(用0.lmol/L無(wú)菌、pH4.4檸檬酸緩沖液配制，經(jīng)0.2μm微孔濾膜過(guò)濾滅菌)，B組腹腔注射等劑量pH4.4檸檬酸緩沖液。注射STZ一周后尾靜脈取血監(jiān)測(cè)C57BL/6小鼠的血

3、糖變化，及時(shí)觀察C57BL/6小鼠的體重變化、尿量變化和飲食狀況。C57BL/6小鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿，體重減輕，血糖高于11.1mmol/L即為糖尿病小鼠模型制備成功。A組成模20只，成模率80％。A組中隨機(jī)選取18只繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)，分為糖尿病組（DM Group）。B組中隨機(jī)選取18只，為對(duì)照組（Control Group）。分別在糖尿病小鼠模型制備成功后第8周、第12周、第20周末隨機(jī)取兩組小鼠各6只，頸椎脫臼法處死小鼠，解剖取睪

4、丸組織，置入10%福爾馬林（4%甲醛）固定，用于石蠟包埋制備組織切片。分別行HE染色、免疫組化染色，通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)小鼠睪丸組織中NGF、VEGF表達(dá)情況。陽(yáng)性對(duì)照由試劑公司提供，應(yīng)用PBS代替一抗的組織切片做陰性對(duì)照，光鏡下陽(yáng)性部位為棕黃色，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色。免疫組化結(jié)果應(yīng)用NDP數(shù)字病理掃描儀采集圖像，每張切片睪丸范圍內(nèi)隨機(jī)選取曲細(xì)精管分布均勻的5個(gè)視野(400×)作為觀察區(qū)，并用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件測(cè)量

5、積分光度值（Integrated optical density IOD），以各組的均值和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行比較。
　　結(jié)果：
　　1、小鼠的一般狀況
　　糖尿病組小鼠實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中，逐漸表現(xiàn)出被毛蓬松，污穢無(wú)澤，易脫落，活動(dòng)減少，明顯多飲、多食、多尿，體重較對(duì)照組減輕明顯，血糖≥11.1mmol/L，明顯高于對(duì)照組（P<0.01）。對(duì)照組小鼠反應(yīng)靈敏、精神狀態(tài)良好，動(dòng)作自如、活躍，毛發(fā)光亮順滑。
　　2、小鼠體重及血糖變化

6、
　　糖尿病組小鼠在造模成功后就出現(xiàn)血糖異常癥狀（血糖≥11.1mmol/L)，為13.74±2.71mmol/L，對(duì)照組血糖在正常水平為4.37±0.89mmol/L，兩組具有極其顯著的差異(P<0.01)。
　　3、糖尿病小鼠睪丸組織形態(tài)改變
　　睪丸組織切片HE染色后，光鏡觀察結(jié)果顯示，糖尿病組曲細(xì)精管萎縮，各級(jí)精母細(xì)胞數(shù)量減少，曲細(xì)精管基膜變薄、破損、缺失。生精上皮結(jié)構(gòu)排列紊亂，生精細(xì)胞脫落，曲細(xì)精管管腔內(nèi)精子

7、減少，支持細(xì)胞出現(xiàn)變性、空泡化。個(gè)別曲細(xì)精管僅見緊貼基膜的支持細(xì)胞及精原細(xì)胞，而其余各級(jí)精母細(xì)胞及精子減少或消失，表現(xiàn)為生精障礙。睪丸組織中間質(zhì)組織增生，毛細(xì)血管管腔閉塞并附血栓。間質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少，胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞核扁圓或橢圓形且核濃染，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)還可見空泡。
　　4、免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果
　　在兩組小鼠睪丸組織中均可發(fā)現(xiàn)NGF、VEGF表達(dá)的陽(yáng)性顆粒，NGF的免疫復(fù)合物位于Sertoli支持細(xì)胞的細(xì)胞核，次級(jí)精母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)

8、，精子細(xì)胞的類圓形泡狀結(jié)構(gòu)中。在實(shí)驗(yàn)組中，隨著試驗(yàn)周數(shù)的增加，小鼠睪丸內(nèi)的NGF明顯呈下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而在對(duì)照組中，隨著試驗(yàn)周數(shù)的增加，NGF無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在周齡相同的小鼠中，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組睪丸內(nèi)的NGF降低，兩組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　小鼠睪丸內(nèi)的VEGF免疫組化復(fù)合物只位于Leydig和Sertoli細(xì)胞內(nèi)。在實(shí)驗(yàn)組中，隨著試驗(yàn)周數(shù)的增加，小鼠

9、睪丸內(nèi)的VEGF明顯呈下降趨勢(shì)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而在對(duì)照組中，隨著試驗(yàn)周數(shù)的增加，VEGF無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在周齡相同的小鼠中，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組VEGF降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　5、VEGF、NGF的相關(guān)性
　　小鼠睪丸組織內(nèi)VEGF與NGF水平在相關(guān)性分析中，存在強(qiáng)正相關(guān)性(r=0.778, P<0.01)。
　　結(jié)論：研究成果表明，在糖尿病小鼠睪丸