先天性心臟病胎兒分子遺傳學(xué)診斷研究.pdf

1、先天性心臟病(Congenital heart disease，CHD)是最常見的出生缺陷?；加邢忍煨孕呐K病的新生兒如果未進(jìn)行及時(shí)的干預(yù)和治療，其中大約有1/3會(huì)在出生后1個(gè)月內(nèi)因嚴(yán)重的病情和畸形而夭折，危害極其嚴(yán)重。流行病學(xué)研究表明環(huán)境因素和遺傳因素共同作用導(dǎo)致了先天性心臟病的發(fā)生，其中遺傳因素起重要作用。對(duì)先心胎兒進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)既可明確遺傳背景、為遺傳咨詢提供重要的信息，對(duì)再次生育夫婦進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估;也對(duì)先天性心臟病胎兒預(yù)后判斷以及外

2、科手術(shù)的效果具有指導(dǎo)價(jià)值。
　　大量研究證實(shí)引起人類先心病的遺傳變異有染色體疾病、基因組疾病、基因突變等多種變異形式。本研究采用包含G顯帶、多重連接探針擴(kuò)增(multiplexligation-dependent probe amplification，MLPA)、單核苷酸多態(tài)性-微陣列比較基因組雜交(Single Nucleotide Polymorphisms array-based comparative genomichy

3、bridization，SNP-array)和外顯子捕獲-高通量測(cè)序(Exon-capture high-throughputsequencing，EC-HTS)綜合技術(shù)系統(tǒng)貫序進(jìn)行先天性心臟病的遺傳學(xué)診斷，尋找致病原因，評(píng)估再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，并幫助判斷胎兒預(yù)后，并評(píng)估該體系應(yīng)用于先天性心臟病胎兒遺傳學(xué)檢測(cè)的效果。
　　本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 先天性心臟病胎兒的拷貝數(shù)變異檢測(cè)
　　目的:探討MLPA技術(shù)和

4、SNP-array技術(shù)在檢測(cè)先天性心臟病胎兒拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNV)中的價(jià)值。
　　方法:選擇超聲心動(dòng)圖診斷為先天性心臟病且其羊水細(xì)胞培養(yǎng)的G顯帶結(jié)果均正常的236例胎兒作為研究對(duì)象;運(yùn)用MLPA技術(shù)檢測(cè)胎兒的基因組22q11.2的微缺失和微重復(fù);陰性結(jié)果樣本(226例)進(jìn)一步采用SNP-array技術(shù)進(jìn)行全基因組拷貝數(shù)變異檢測(cè)，得到胎兒CNV結(jié)果，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，明確導(dǎo)致先心的遺傳學(xué)病因，

5、進(jìn)行遺傳咨詢。
　　結(jié)果:236例胎兒中共檢測(cè)出10例22q11.2區(qū)域拷貝數(shù)變異，陽性檢出率為4.2％(10/236)，包括9例微缺失和1例微重復(fù)，對(duì)其父母溯源發(fā)現(xiàn)8例微缺失為新發(fā)，1例微缺失及1例微重復(fù)均遺傳于父親。SNP-array全基因組拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，226例胎兒中共發(fā)現(xiàn)71例CNV，經(jīng)過數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，其中23例CNV為致病性，致病性CNV檢出率為10.1％(23/226);40例CNV為良性病變，8例CNV臨床意義不

6、明。MLPA結(jié)合SNP-array用于先天性心臟病胎兒遺傳學(xué)檢測(cè)陽性檢出率較常規(guī)核型分析提高14.0％(33/236)。
　　結(jié)論:基因組拷貝數(shù)變異是先心病胎兒的重要致病原因之一，MLPA技術(shù)和SNP-array技術(shù)可顯著提高先天性心臟病胎兒的CNV檢出率，有助于產(chǎn)前咨詢。
　　第二部分 先天性心臟病胎兒基因突變的檢測(cè)——外顯子捕獲-高通量測(cè)序技術(shù)
　　目的:運(yùn)用外顯子捕獲-高通量測(cè)序技術(shù)尋找先天性心臟病(Congen

7、ital heartdisease，CHD)胎兒可能存在的遺傳學(xué)致病突變，并探討外顯子捕獲結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的價(jià)值。
　　方法:超聲心動(dòng)圖診斷為先天性心臟病且G顯帶、MLPA和SNP-array檢測(cè)結(jié)果均正常的44例胎兒作為研究對(duì)象;將與人類先天性心臟病相關(guān)的63個(gè)已知致病基因作為檢測(cè)靶點(diǎn)并制成捕獲芯片。各個(gè)樣本DNA進(jìn)行外顯子捕獲后并用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序;原始數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾、數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)、生物學(xué)軟件分析后得到最終病理

8、性突變位點(diǎn);Sanger測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證病理性突變位點(diǎn);并進(jìn)行遺傳咨詢。
　　結(jié)果:在44例先天性心臟病胎兒中共檢測(cè)到3560個(gè)基因突變位點(diǎn)，數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)、生物信息學(xué)分析后得到16個(gè)可疑的致病性病理突變，其中5個(gè)突變點(diǎn)為已報(bào)道的致病性突變，其余11個(gè)突變位點(diǎn)尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，明確致病性突變陽性檢出率為11.4％;根據(jù)突變類型分類，其中2個(gè)為移碼突變，14個(gè)為錯(cuò)義突變，涉及10個(gè)基因包括:CITED2、CHD7、NOTCH2、JAG1、M

9、YH、ZFPM、HAND2、MLL2、MYH6和MID1，其中HAND2、MYH6和MID1基因遺傳方式未明，其余7個(gè)基因的遺傳方式為常染色體顯性遺傳。16個(gè)突變位點(diǎn)的Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果與高通量測(cè)序結(jié)果均一致。父母溯源分析發(fā)現(xiàn)檢測(cè)得到的致病性突變點(diǎn)均為新發(fā)突變。
　　結(jié)論:本研究采用定制的外顯子捕獲芯片結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)在44例先天性心臟病胎兒中檢測(cè)出5例患者存在已知致病性突變是胎兒致病原因，11例存在可疑病理性致病突變。提