造血干細(xì)胞移植免疫重建中脫敏療法誘導(dǎo)第三方免疫耐受的研究.pdf

1、遺傳代謝?。╥nherited metabolic diseases，IMD）是一組由單一酶活性缺陷引起的遺傳病，該酶是蛋白質(zhì)、脂肪或碳水化合物正常代謝所必須，酶缺陷導(dǎo)致有害的代謝產(chǎn)物蓄積引起疾病。目前發(fā)現(xiàn)IMD超過(guò)500種，這些疾病經(jīng)常導(dǎo)致患者存活時(shí)間受限、多系統(tǒng)受累及進(jìn)行性進(jìn)展;絕大多數(shù)IMD患者在兒童時(shí)期出現(xiàn)臨床癥狀，疾病進(jìn)展較慢的患者可能在成年出現(xiàn)癥狀。目前對(duì)嚴(yán)重IMD治療仍十分有限，治療原則是減少毒物蓄積、補(bǔ)充需要、促進(jìn)排泄;

2、治療手段如飲食療法、酶替代或底物降解、骨髓移植或肝移植等;但任何一種治療方法都存在弊端。如飲食療法可導(dǎo)致IMD患者營(yíng)養(yǎng)不良;酶替代治療不能通過(guò)血-腦屏障改善有毒代謝產(chǎn)物引起的腦損傷，且治療費(fèi)用昂貴;底物降解治療經(jīng)常被抗蛋白質(zhì)抗體阻斷，導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)、過(guò)敏性休克等;造血干細(xì)胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)不能及時(shí)改善嚴(yán)重遺傳代謝病患者腦損傷等。
　　嚴(yán)重的IMD患者通常

3、伴有腦損傷，臨床表現(xiàn)主要為智力、精神下降;嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)疾病經(jīng)常導(dǎo)致患者死亡。動(dòng)物研究表明移植的HSC在大腦分化為小膠質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)血-腦屏障釋放有功能的酶，發(fā)揮治療腦損傷的作用。但是移植的HSC分化為小膠質(zhì)細(xì)胞所需時(shí)間較長(zhǎng)，小鼠大約需要6月，人腦大約需要6-12月;因此HSCT不能及時(shí)改善腦損傷。
　　利用神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell，NSC)具有自我更新能力和分化功能，已成功用于治療多種神經(jīng)系統(tǒng)損傷及神經(jīng)退行性疾病

4、模型，如急性腦缺血損傷、新生鼠缺氧缺血腦損傷、阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化癥、帕金森病等。神經(jīng)干細(xì)胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型有一定的療效，但細(xì)胞移植后宿主介導(dǎo)的排斥反應(yīng)及存活率低，限制了其治療作用的最大發(fā)揮。理論上講，人類來(lái)源的供者細(xì)胞是最有價(jià)值的，因?yàn)橹挥腥祟悂?lái)源的細(xì)胞將來(lái)可能被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床試驗(yàn)治療IMD。
　　為了提高人來(lái)源細(xì)胞異種移植存活，通過(guò)新生期大、小鼠人類細(xì)胞脫敏，誘導(dǎo)成年期細(xì)胞移植耐受的研究已有報(bào)道。2009年Claire

5、 M Kelly等報(bào)道新生SD大鼠生后0-5d腹腔注射105人來(lái)源NSC(human neural stem cell，hNSC)，10-12周后大腦皮層或紋狀體移植(2.5-5)×105 hNSC，移植后12-40周植入率增高，移植的細(xì)胞能長(zhǎng)期存活。2012年研究報(bào)道新生期BALB/c小鼠和Wistar大鼠腹腔注射105 hNSC，6周后大腦移植3×105hNSC，移植后2-3周hNSC不能檢測(cè)到。2014年Virginia B.Ma

6、ttis等報(bào)道新生小鼠生后2-3d腹腔注射105hNSC，8周后大腦移植2×105 hNSC，移植后4周hNSC不能檢測(cè)到。2013年研究報(bào)道以成年Wistar大鼠腦梗模型為基礎(chǔ)進(jìn)行hNSC脫敏或免疫抑制劑治療，hNSCT后2周移植的hNSC幾乎不能檢測(cè)到;提示在局部腦損傷Wistar大鼠，不同途徑免疫抑制不能延長(zhǎng)移植的人臍血來(lái)源NSC存活。2016年Andreas heuer等研究報(bào)道新生期SD大鼠生后2d和4d進(jìn)行腹腔注射分化前的人

7、來(lái)源胚胎干細(xì)胞進(jìn)行脫敏，成年后（最小15周齡）建立多巴胺能纖維束損傷模型，建模后4-5周進(jìn)行人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)前體細(xì)胞大腦移植，移植后18-22周89％大鼠可檢測(cè)到人類細(xì)胞，提示新生期人來(lái)源細(xì)胞脫敏可以實(shí)現(xiàn)成年后人來(lái)源細(xì)胞移植長(zhǎng)期存活。
　　以上研究提示新生鼠除SD大鼠外，其它如BALB/c、C57BL/6、NOD SCID、B6C3F1/J、FVB(P1-4)小鼠及Wistar大鼠，新生期腹腔注射人來(lái)源細(xì)胞進(jìn)行脫敏，成年后大

8、腦移植均不能耐受。SD大鼠細(xì)胞脫敏可以實(shí)現(xiàn)免疫耐受，可能與該物種是遠(yuǎn)交系相關(guān);也可能新生期SD大鼠較同期其它類型鼠免疫更不健全。建立清髓異基因造血干細(xì)胞(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)模型摧毀免疫系統(tǒng)，模擬新生期鼠免疫不健全;探討allo-HSCT免疫不健全時(shí)期進(jìn)行第三方人來(lái)源細(xì)胞脫敏，免疫健全后進(jìn)行細(xì)胞移植能否實(shí)現(xiàn)耐受。文獻(xiàn)報(bào)道HSCT模型多選

9、用小鼠進(jìn)行研究，受體BALB/c小鼠和供體C57BL/6小鼠可以成功建立allo-HSCT模型，可以模擬臨床allo-HSCT免疫不健全時(shí)期。因此本研究選用BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠建立allo-HSCT模型。本研究可為IMD患者allo-HSCT不能及時(shí)改善腦損傷提供可參考的途徑，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。
　　目的:
　　基于新生期hNSC脫敏研究，致死性全身放射摧毀小鼠免疫及造血功能，通過(guò)小鼠allo-HSCT解救，在

10、免疫重建過(guò)程中應(yīng)用hNSC多次脫敏，實(shí)現(xiàn)免疫重建后對(duì)hNSC的免疫耐受。
　　方法:
　　9-12周雌性BALB/c小鼠為受體鼠，9-12周雌性C57BL/6小鼠為供者鼠。分離供者鼠骨髓細(xì)胞，去T細(xì)胞進(jìn)行尾靜脈骨髓移植，建立穩(wěn)定嵌合清髓小鼠allo-HSCT模型。模型建立成功后，90只模型小鼠隨機(jī)分為三組:A組(NSCT組)、B組（脫敏組）、C組（環(huán)孢素組）。B組在HSCT后第1、3、7d進(jìn)行hNSC腹腔注射脫敏，A、C組在

11、相同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行腹腔注射50ul生理鹽水。HSCT穩(wěn)定嵌合及供者T細(xì)胞植入后行小鼠大腦hNSCT，C組移植前1d至脫臼處死當(dāng)日，每日行腹腔注射10mg/kg環(huán)孢素，A、B組每日行腹腔注射10mg/kg環(huán)孢素相同體積的生理鹽水。HNSCT后2、8、12W，三組均行hNSC體外殺傷試驗(yàn)、體內(nèi)存活率及分化、排斥反應(yīng)、炎性反應(yīng)檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1.受體BALB/C小鼠經(jīng)致死性放射清髓后，供體C57BL/6小鼠骨髓去T細(xì)胞HSCT

12、; HSCT后2周，受體鼠存活率為100％，小鼠精神可，活動(dòng)有力;HSCT后4周，受體鼠存活率約80％，無(wú)脫毛癥狀。
　　2.清髓小鼠allo-HSCT后4、8周，供體鼠細(xì)胞嵌合率均為76％±1％，供體鼠T細(xì)胞占植入細(xì)胞的37％±1％。
　　3.人來(lái)源NSCT后12周，進(jìn)行受體BALB/C小鼠脾臟T細(xì)胞體外殺傷hNSC實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。A、B、C組體外殺傷率分別為28.26％±2.80％、23.94％+2.11％、23.62％±0.

13、15％，P=0.36。三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.人來(lái)源NSCT后2、8、12周，A、B、C組移植的hNSC存活率進(jìn)行比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NSCT后2周，A、B、C組移植的hNSC存活率分別為0.42％±0.02％、0.45％％±0.05％、0.53％±0.01％，P=0.08; HNSCT后8周，A、B、C組移植的hNSC存活率分別為0.21％±0.01％、0.18％±0.02％、0.24％±0.02％，P=0.20

14、; HNSCT后12周，A、B、C組移植的hNSC存活率分別為0.16％±0.01％、0.16％±0.01％、0.20％±0.01％，P=0.26。
　　5.人來(lái)源NSCT后2、8、12周，小鼠大腦冰凍切片免疫熒光染色提示:hNSCT后2、8、12周，三組排斥反應(yīng)及炎性反應(yīng)指標(biāo)MHC-Ⅱ、CD3、Iba-1、CD68均為陽(yáng)性。移植的hNSC分化情況:移植后2周，三組GFAP（星形膠質(zhì)細(xì)胞）、β-tubulin（神經(jīng)元）免疫熒光染色

15、均為陰性;移植后8、12周，GFAP免疫熒光染色三組均為陽(yáng)性，β-tubulin免疫熒光染色三組均為陰性。
　　結(jié)論:
　　1.骨髓去T細(xì)胞移植可以成功建立清髓異基因小鼠HSCT模型。
　　2.清髓小鼠allo-HSCT免疫重建中，盡管hNSC脫敏療法不能實(shí)現(xiàn)hNSC免疫耐受，但是可以少數(shù)長(zhǎng)期存活。
　　3.少數(shù)存活的hNSC可以長(zhǎng)期存活，并且短期可能分化為能分泌多種酶的星形膠質(zhì)細(xì)胞，相對(duì)供者HSC于大腦分化為能