異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后中樞T細(xì)胞免疫重建的初步研究.pdf

1、目的:
　　本研究以我院用清髓性FBCA預(yù)處理方案接受HSCT的移植患者為研究對象，測定移植后不同時間點T細(xì)胞各亞群(CD3+/CD4+/CD8+)數(shù)量和TREC拷貝數(shù)，并將其與年齡、移植后感染、GVHD、復(fù)發(fā)等因素進行分析，初步探究在該清髓性FBCA預(yù)處理聯(lián)合G-CSF動員外周造血干細(xì)胞的非體外去T細(xì)胞移植模式下，患者移植后T細(xì)胞免疫重建特別是中樞免疫重建的一般規(guī)律，以及同移植后預(yù)后因素的相關(guān)關(guān)系。
　　方法:
　　

2、1.研究對象
　　選取2013年1月到2014年1月在我院血液科行HSCT的部分血液疾病患者。共有20例患者入組研究，中位年齡18歲（3-47歲），其中12例年齡小于20歲，8例年齡大于等于20歲，男性11例，女性9例。6例患者診斷為急性髓系白血病(AML)，4例患者診斷為急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)，2例患者診斷為慢性髓系白血病(CML)，5例診斷為再生障礙性貧血(SAA)，2例診斷為地中海貧血，1例診斷為骨髓增生異常綜合癥(M

3、DS)。按照危險度分層，7例患者診斷為中危，13例為高危。
　　2.造血干細(xì)胞移植
　　患者的健康親屬作為供者選擇的來源，采用直接核苷酸序列分析(SBT，Sequenceing-based typing，高分辨分型)以及微量序列特異引物聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-SSP，sequence-specific primers PCR，中分辨分型）技術(shù)進行供受者HLA配型，選擇高分辨分型至少5個位點以上或者中分辨分型至少3個位點以上相合

4、的親屬作為供者。20例患者均采用我們建立的FBCA預(yù)處理方案:氟達(dá)拉濱Flu30mg/m2(-9至-5d);白舒非BU0.8mg/kg/q6h(-8至-5d);環(huán)磷酰胺CY60mg/kg(-3至-2d);兔抗人胸腺細(xì)胞球蛋白ATG，全相合移植患者1.25 mg/kg/d(-3至-1d)，單倍體相合患者2.5 mg/kg/d(-5至-1d)。移植物采用粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF，granulocyte colony-stimulati

5、ng factor)動員的外周血干細(xì)胞，不做體外去T細(xì)胞處理。GVHD的預(yù)防措施包括常規(guī)的環(huán)孢素(CsA，3mg/kg/d)以及甲氨蝶呤(MTX，15mg/m2+1d，10mg/m2+3/+6/+11d)的應(yīng)用，環(huán)孢素一般在移植后180天逐漸減量停用。在輸注干細(xì)胞后每日使用G-CSF以及重組人血小板生成素(rhTPO，Recombinant human-thrombopoietin)等直至造血重建的恢復(fù)。
　　3.T細(xì)胞亞群數(shù)量檢

6、測
　　采集患者在移植后+1月、+3月、+6月以及+12月的外周血，采用流式細(xì)胞術(shù)分析的方法，監(jiān)測移植后+1月、+3月、+6月以及+12月患者外周血中CD3+、CD4+及CD8+T細(xì)胞亞群的數(shù)量，了解患者外周的T細(xì)胞免疫狀態(tài)。
　　4.外周血TREC水平的監(jiān)測
　　采集患者移植后+1月、+3月、+6月以及+12月的外周血中的單個核細(xì)胞(PBMNC，peripheral blood mononuclear cell)，用

7、試劑盒提取基因組DNA。采用文獻(xiàn)中報道的引物（暨南大學(xué)血液病研究所李揚秋教授贈送），采用實時定量PCR方法檢測患者外周血中100000個PBMNCs中TREC的拷貝數(shù)，評估患者的胸腺近期輸出T細(xì)胞功能。
　　5.移植后相關(guān)因素與免疫重建的關(guān)系
　　將患者移植后外周血T淋巴細(xì)胞亞群絕對數(shù)以及TREC拷貝數(shù)，采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)、TREC及同移植后相關(guān)因素（包括年齡、感染、GVHD、復(fù)發(fā)）的關(guān)系，

8、雙邊檢驗P值小于0.05為有顯著意義。
　　結(jié)果:
　　1.在我院清髓性FBCA預(yù)處理的HSCT后，20例進入研究統(tǒng)計。20例患者移植后均造血重建，STR-PCR檢測均為供者細(xì)胞完全植入。中性粒細(xì)胞植入的中位時間為13天（11-18天），血小板植入的中位時間為14天（9-20天）。移植后100天內(nèi)發(fā)生急性GVHD(aGVHD，acute graft-versus-host disease)的發(fā)生率為35％，aGVHDⅠ度的患

9、者6例，aGVHDⅡ度的患者1例，沒有嚴(yán)重aGVHD的發(fā)生。移植后慢性GVHD(cGVHD，chronic graft-versus-host disease)的發(fā)生率為15％，3例患者出現(xiàn)局限性的cGVHD。4例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，本組病人的復(fù)發(fā)率為20％。20例患者中只有1例死亡，死亡原因為復(fù)發(fā)及肝臟、腸道Ⅳ度GVHD。
　　2.所有患者在移植后1個月外周血CD3+細(xì)胞數(shù)339.72±69.79/μL，移植后3個月CD3+細(xì)胞數(shù)上升

10、至405.88±85.68/μL，到6個月時細(xì)胞數(shù)上升為810.05±208.11/μL，在移植后12個月時為1207.99±250.72/μL; CD4+細(xì)胞在移植后1個月為細(xì)胞數(shù)138.98±41.96/μL，移植后3個月CD4+細(xì)胞數(shù)下降至126.50±17.02/μL，到6個月時細(xì)胞數(shù)上升為228.91±66.95/μL，在移植后12個月時為358.14±195.46/μL; CD8+細(xì)胞數(shù)在移植后1個月、3個月、6個月以及12

11、個月時分別為255.63±47.23/μL、371.91±62.69/μL、775.82±73.26/μL及971.87±138.56/μL。
　　3.20例患者移植后1個月外周血TREC拷貝數(shù)為0.93±2.45拷貝/105細(xì)胞，3個月時為7.56±7.64拷貝/105細(xì)胞，6個月及12個月分別為85.83±54.80拷貝/105細(xì)胞和148.62±77.61拷貝/105細(xì)胞。與正常人相比，20例患者移植后不同時間外周血TREC

12、拷貝數(shù)均低于正常人群，但隨移植時間的延長，TREC數(shù)量增加，表明中樞免疫功能的重建隨移植后時間的延長逐漸恢復(fù)，與CD4+T細(xì)胞比較TREC恢復(fù)更慢。
　　4.進一步分析表明，年齡對免疫功能的重建有一定影響。年齡≥20歲患者在移植后不同時間外周T細(xì)胞亞群絕對數(shù)均低于年齡＜20歲患者，尤其是在移植后6個月以及12個月的CD4+細(xì)胞數(shù)上是有顯著性差異（P值分別為0.028以及0.0001）。而反映中樞免疫功能重建的TREC拷貝數(shù)，年齡≥

13、20歲患者在移植后6個月及12個月的TREC拷貝數(shù)也明顯低于年齡＜20歲組的病人（P值分別為0.012以及0.002）。這些結(jié)果提示無論是外周T細(xì)胞還是反映中樞免疫功能的TREC，年輕患者更容易在移植后重建。
　　5.移植后感染與移植后免疫功能狀態(tài)有非常密切的關(guān)系，中樞免疫重建延遲與移植后遲發(fā)霉菌感染有關(guān)。20例患者移植后17例病人出現(xiàn)不同程度的感染。其中年齡＜20歲組移植后6個月內(nèi)，12例出現(xiàn)EB病毒感染，13例CMV感染，3例

14、出血性膀胱炎，2例單純皰疹病毒感染，1例肺部霉菌性感染，而年齡≥20歲組移植6個月內(nèi)，5例出現(xiàn)EB病毒感染，5例CMV感染，4例出血性膀胱炎，1例單純皰疹病毒感染，1例肺部霉菌性感染。移植6個月后，年齡＜20歲組只有1例出現(xiàn)肺部霉菌感染，而年齡≥20歲組出現(xiàn)5例肺部霉菌感染，1例單純皰疹病毒。移植6個月后發(fā)生霉菌感染的患者在移植后12個月CD4+T細(xì)胞數(shù)及低于未發(fā)生霉菌感染的人（P值為0.046），而且移植后6個月及12個月的TREC拷

15、貝數(shù)平均水平也要低于未發(fā)生感染的患者(P值分別為0.044及0.003)。
　　無論是aGVHD、cGVHD或復(fù)發(fā)患者，與未發(fā)生該事件的患者相比兩者移植后T細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)及TREC拷貝數(shù)統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　1.在我們建立的FBCA預(yù)處理及G-CSF動員外周血干細(xì)胞的非體外去T細(xì)胞移植方案下，患者在移植后的免疫重建需要較長時間，移植后1年中樞免疫功能尚未恢復(fù)正常，與國內(nèi)外類似研究結(jié)果是相似的。
　

16、　2.年齡是影響移植后中樞免疫重建的重要因素，中樞免疫功能的重建低下與移植后遲發(fā)霉菌感染相關(guān)。年齡＜20歲組移植后T細(xì)胞重建快于年齡≥20歲組，年齡＜20歲的患者在移植后期發(fā)生霉菌感染次數(shù)明顯少于年齡≥20歲組的患者，進一步發(fā)現(xiàn)發(fā)生霉菌感染的患者T細(xì)胞重建慢于未發(fā)生霉菌感染者，這提示移植后年齡＜20歲組在移植遠(yuǎn)期較少的感染可能同年輕患者胸腺功能較好，T細(xì)胞免疫恢復(fù)快有關(guān)。
　　3.接受異基因造血干細(xì)胞移植的患者在移植后胸腺近期輸出