甘草苷元生物轉化和防治腫瘤及肝慢性損傷機制研究.pdf

1、中藥材真菌生物轉化為豐富和深入開發(fā)中藥材藥用有效成分和新的應用具有重要意義，但也面臨中藥材成分復雜，多因素影響轉化效果的難題。如甘草黃酮中甘草苷元有重要藥用價值，但在甘草木質(zhì)成分中苷元含量微少。因此，論文在選擇甘草中藥材食藥用真菌轉化體系的基礎上，深入探究甘草生物轉化與其有效部位成分改變的內(nèi)在聯(lián)系、作用規(guī)律和生物轉化機制，并進一步解析甘草裂褶菌轉化有效成分甘草苷元在腫瘤防治的藥理作用和機制。獲得主要結果如下：
　　以12種重要中藥

2、材為原料，研究了來自不同生境的17種食藥用真菌對多種中藥材的生物轉化作用，發(fā)現(xiàn)不同中藥材誘導食藥用菌漆酶活性差異明顯，同時影響到中藥材的抗氧化活性，基于此確立了甘草真菌固體轉化模式。通過比較多種食藥用真菌對甘草有效部位改性和富集的影響，發(fā)現(xiàn)不同生物學屬性的藥用真菌對甘草有效部位的影響效果差異顯著，確定了適合甘草有效部位生物轉化的食藥用菌優(yōu)勢菌株裂褶菌 DS1，分類地位為擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、裂褶菌科和裂褶菌屬(Schizophyl

3、lum commune Fr.)。
　　對DS1固體發(fā)酵甘草工藝進行了優(yōu)化，在優(yōu)化條件培養(yǎng)溫度28℃、pH7.0和固液比1:1.2下，甘草原料經(jīng)食藥用菌菌株DS1轉化14天后，抗氧化能力提高2.6倍。對不同處理后的甘草樣品分離純化獲得了有效轉化的產(chǎn)物單體，通過組分測定、HPLC、液相質(zhì)譜聯(lián)用和核磁分析相應分子結構，證明了轉化產(chǎn)物為甘草苷元。甘草苷轉化效率高達91.3％，甘草苷元得率是未轉化甘草樣品的5.4倍。
　　通過化合物

4、結構變化分析，解析出甘草苷元是由于甘草中糖苷化物的去糖苷化轉化生成，利用飽和硫酸銨鹽析、疏水柱和陰離子柱層析，分離獲得裂褶菌DS1來源β-葡萄糖苷酶的純酶，明晰了該酶分子量約106KD，最適溫度約為50℃，最適pH值約為5.0～6.0。比較純酶、胞外液和裂褶菌對甘草的轉化證實：在相同甘草底物濃度及相同酶活條件下，DS1來源β-葡萄糖苷酶和 DS1胞外粗酶液對甘草苷轉化率分別為20.3%和22.1%，驗證了裂褶菌通過β-葡萄糖苷酶催化甘草

5、苷去糖苷化轉化獲得甘草苷元為其生物轉化途徑之一。與單一酶轉化及胞外初酶液轉化率相比，DS1對甘草中的甘草苷轉化可達90.2%，表明DS1還有可能通過其他途徑增強甘草苷元的生物轉化能力。
　　對DS1生物轉化產(chǎn)物甘草苷元的生物功能研究結果顯示：來自生物轉化的甘草苷元有效部位能夠有效抑制人肝癌細胞活性，下調(diào)低氧信號 HIF1β和它的下游靶基因VEGF表達水平，不利于肝癌細胞SMMC7721的惡性進展。同時影響肝癌HepG2細胞HIF1

6、β下調(diào)，細胞自噬基因Beclin-1上調(diào)，細胞周期基因CyclinD1輕微下調(diào)，調(diào)控肝癌HepG2細胞凋亡有關的生物學行為。表明DS1轉化來源的甘草苷元有效部位通過影響低氧效應相關基因表達，經(jīng)肝癌細胞低氧信號途徑抑制肝癌細胞惡性進展和誘發(fā)癌細胞凋亡。在致癌劑CCl4誘導的SD大鼠肝損傷，受甘草苷元干預的SD大鼠肝的抗氧化能力增強，SOD和GSH-Px活性分別上升23.5%和16.3%，表明甘草苷元提升了相應SOD2和GSH-Px水平，它

7、們的mRNA表達水平達到97.1%和102.3%；脂質(zhì)氧化水平MDA較對照組下降50%；炎癥損傷RelA和MMP2下降66% and58%；線粒體功能受甘草苷元保護，PGC-1α,ND1和Bcl-x上升30-50%，表明甘草苷元是通過PGC-1α途徑促進抗氧化酶活性，抑制氧化代謝和恢復線粒體途徑抗凋亡基因、抑制炎癥和致纖維化反應從而阻止致癌劑CCl4引發(fā)的大鼠慢性肝損傷和惡性變，甘草苷元防護化學致癌劑對肝細胞癌變潛在特異分子靶點的抗氧化