多細(xì)胞因子調(diào)控hsBAFF通過Erk1-2和S6K1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)B細(xì)胞增殖機(jī)理研究.pdf

1、本研究運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)、流式細(xì)胞分析、Western blotting、 RNA干擾等細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)和方法，以Raji細(xì)胞系及小鼠脾B淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，研究了多細(xì)胞因子在調(diào)控hsBAFF依賴的B細(xì)胞增殖和存活中的作用，解析了Erk1/2和S6K1信號(hào)通路在多細(xì)胞因子增強(qiáng)hsBAFF促進(jìn)B細(xì)胞增殖與存活中的重要性及意義;最后，初步探討了hsBAFF對小鼠脾B淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞的促增殖作用以及相互關(guān)系。具體結(jié)

2、果如下:
　　1.多細(xì)胞因子調(diào)節(jié)hsBAFF依賴的B細(xì)胞增殖和存活
　　用不同濃度的hsBAFF(0-0.25μg/ml)刺激Raji細(xì)胞48 h、或用0-100 ng/mlIL-2、IL-4、IFN-γ或TNF-α分別刺激Raji細(xì)胞48 h、或用IL-2（10和50 ng/ml）、IL-4（5和25 ng/ml）、IFN-γ（10和100 ng/ml），TNF-α（10和50 ng/ml）分別和0.25μg/ml hsB

3、AFF聯(lián)合共刺激Raji細(xì)胞48 h。然后，MTS和細(xì)胞計(jì)數(shù)分析以及細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)活性計(jì)數(shù)和細(xì)胞流式分析。結(jié)果顯示，hsBAFF劑量依賴地促進(jìn)B細(xì)胞增殖與存活;IL-2、IL-4、IFN-γ、 TNF-α也分別呈濃度依賴性地促進(jìn)B細(xì)胞增殖與存活;IL-2、IL-4、IFN-γ、 TNF-α分別提高h(yuǎn)sBAFF促進(jìn)B細(xì)胞的增殖與存活。提示:合適的IL-2、IL-4、IFN-γ或TNF-α增強(qiáng)hsBAFF依賴的B細(xì)胞增殖與存活。
　　2.

4、多細(xì)胞因子增強(qiáng)hsBAFF激活Erk1/2和S6K1通路促進(jìn)B細(xì)胞增殖和存活
　　小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞和/或Raji細(xì)胞用0-0.25μg/ml hsBAFF處理12h，或用0.25μg/ml hsBAFF處理0-24 h，或用IL-2（10和50 ng/ml）、IL-4（5和25 ng/ml）、IFN-γ（10和100 ng/ml），TNF-α（10和50 ng/ml）單獨(dú)或與hsBAFF(0.25μg/ml)聯(lián)合處理12h或48

5、 h，或用50 ng/ml IL-2、25 ng/ml IL-4、100 ng/ml IFN-γ、50 ng/mlTNF-α分別單一或多重聯(lián)合0.25μg/ml hsBAFF處理12h或48 h;細(xì)胞也分別用5μM U0126預(yù)處理1h或用0.2μg/ml雷帕霉素預(yù)處理2h，然后用IL-2、IL-4、IFN-γ、 TNF-α分別單一或多重聯(lián)合hsBAFF處理12h或48 h。此外，在shRNAErk1/2、shRNA S6K1和shRN

6、A GFP分別感染Raji細(xì)胞后用IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α分別單一或多重聯(lián)合hsBAFF處理12 h或48 h。然后，MTS分析細(xì)胞增殖表現(xiàn)、臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活的細(xì)胞數(shù)量，Western blot分析Erk1/2、S6K1和S6蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示:IL-2、IL-4、IFN-γ、 TNF-α單獨(dú)或多重聯(lián)合hsBAFF通過增強(qiáng)Erk1/2和S6K1/S6磷酸化表達(dá)更加有力地促進(jìn)B細(xì)胞增殖與存活;應(yīng)用U0126抑制或shRN

7、A干擾下調(diào)Erk1/2表達(dá)明顯阻滯IL-2、IL-4、IFN-γ、 TNF-α單獨(dú)或多重聯(lián)合hsBAFF促進(jìn)的Erk1/2磷酸化以及B細(xì)胞增殖與存活;應(yīng)用雷帕霉素抑制或shRNA干擾下調(diào)S6K1表達(dá)也顯著降低IL-2、IL-4、IFN-γ、 TNF-α單獨(dú)或多重聯(lián)合hsBAFF促進(jìn)的S6K/S6的磷酸化及B細(xì)胞增殖和存活。提示:單一或多重IL-2、IL-4、IFN-γ和/或TNF-α增強(qiáng)hsBAFF激活Erk1/2和S6K1通路促進(jìn)B細(xì)

8、胞增殖和存活。
　　3.hsBAFF刺激小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞增殖及其相互關(guān)系
　　小鼠脾B淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞分別用4μg/mL LPS或20μg/mL PHA或聯(lián)合0.25μg/ml hsBAFF處理48 h;或混合的小鼠脾B淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞用4μg/mL LPS或20μg/mL PHA聯(lián)合0.25μg/ml hsBAFF處理48 h;或收集0.25μg/ml hsBAFF刺激的小鼠脾

9、B淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液分別與用4μg/mL LPS處理的小鼠脾B細(xì)胞混合培養(yǎng)48 h。MTS分析細(xì)胞增殖和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化刺激指數(shù)。結(jié)果顯示:hsBAFF能有效地促進(jìn)小鼠脾B淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞增殖以及小鼠脾B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率（刺激指數(shù)），同時(shí)hsBAFF刺激的CD4+T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液具有顯著增強(qiáng)hsBAFF促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖作用。提示:hsBAFF刺激B淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞增殖:hsBAFF可通過由hsBAFF