海洋芽孢桿菌(EYB-5)酯酶ETM-b的分離制備和固定化研究.pdf

1、微生物酯酶ETM-b，由海洋芽孢桿菌(Bacillus，EYB-5)分泌產(chǎn)生，本文針對(duì)酯酶的分離制備和固定化、游離酯酶和固定化酯酶的酶學(xué)性質(zhì)、催化動(dòng)力學(xué)和熱失活動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，以期為進(jìn)一步研究海洋酯酶ETM-b及其固定化酶的酶學(xué)特性提供基礎(chǔ)。
　　 海洋芽孢桿菌EYB-5胞內(nèi)存在兩種酯酶同工酶ETM-a和ETM-b。將菌體破碎后低溫高速離心(10000r/min，25min，4℃)得到粗酶液，粗酶液再通過(guò)超濾濃縮、硫酸銨鹽

2、析、Phenyl Sepharose Fast Flow疏水層析、Q Sepharose Fast Flow離子交換層析和凝膠柱層析可有效分離得到酯酶ETM-b。
　　 采用海藻酸鈉包埋法、明膠包埋交聯(lián)法、殼聚糖吸附交聯(lián)法固定化海洋芽孢桿菌酯酶ETM-b，比較了三種固定化方法的效果。其中海藻酸鈉制備的固定化酶活性回收率較低，在磷酸鹽緩沖液中小球容易破裂；明膠固定化酶活性回收能達(dá)到66％以上，但操作穩(wěn)定性差，使用4次后不能回收；殼

3、聚糖固定化酶使用10次，相對(duì)活性保留70％，具有良好的操作穩(wěn)定性、機(jī)械強(qiáng)度高，固定化效果好，選取殼聚糖作為固定化載體。采用中心復(fù)合設(shè)計(jì)對(duì)殼聚糖吸附交聯(lián)法固定化酯酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳固定化條件：2％殼聚糖溶液制成小球后，小球與酶液按4.3∶3(g/mL)質(zhì)量體積比混合，吸附30min后，以0.11％的戊二醛溶液交聯(lián)63min，活性回收74.08％。
　　 與游離酶相比，固定化酯酶ETM-b最適pH值向酸性方向偏移，由8.0

4、降低到7.0，最適溫度由50℃提高到60℃。pH穩(wěn)定性范圍由pH6-11擴(kuò)大到pH3-11、溫度穩(wěn)定性范圍提高了20℃，此外固定化酶的貯藏穩(wěn)定性也得到很大提高，4℃下保存60天，固定化酶活性能保留80％。Na+、K+、Ca2+、Li+、Mn2+對(duì)酯酶和固定化酶有不同的激活作用，Mg2+對(duì)酯酶的作用不明顯。Fe2+、A13+、Zn2+、Ba2+、Cu2+、Fe3+和Ag+對(duì)酯酶和固定化酶有抑制作用，Zn2+、Cu2+、Fe3+和Ag+的抑

5、制作用最為顯著。用殼聚糖制備的固定化酶在非水介質(zhì)中具有轉(zhuǎn)化α-乙酸萘酯的能力，在選擇的16種有機(jī)溶劑中，固定化酶在異辛烷、正辛烷、正己烷中活力最高。
　　 在最適條件下，酯酶和固定化酶催化α-乙酸萘酯的反應(yīng)都遵Michaelis-Menten方程式，游離酶：Km=0.329mmol/L，最大反應(yīng)速率Vmax=6.28 mol/L-min；固定化酶：Km=1.643 nmol/L，最大反應(yīng)速率Vmax=6.29 mol/L·min

6、。酯酶ETM-b經(jīng)固定化后Km相比游離酶有所增大，酯酶與底物的結(jié)合能力減弱。Zn2+和Cu2+對(duì)固定化酶有顯著的抑制作用，當(dāng)Zn2+和Cu2+的濃度達(dá)到10mmol/L時(shí)，酶活損失嚴(yán)重，活性僅能保留5％以下。通過(guò)研究Zn2+和Cu2+對(duì)固定化酶動(dòng)力學(xué)的影響可知，Zn2+對(duì)酯酶具有非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，Cu2+對(duì)酯酶產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。
　　 深入研究了酯酶和固定化酶的熱失活動(dòng)力學(xué)，酯酶在60℃、70℃下、固定化酯酶在70℃、80℃下