粘著斑激酶通過整合素β1對(duì)肺成纖維細(xì)胞遷移的影響機(jī)制.pdf

1、目的：研究粘著斑激酶（Focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）通過整合素β1對(duì)肺成纖維細(xì)胞遷移影響的效果和機(jī)制。
　　方法：
　　1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　1.1、人肺成纖維細(xì)胞(Human Lung Fibroblasts,HLFs)從美國(guó)菌種保藏中心（American Type Culture Collection,ATCC）購(gòu)買。細(xì)胞在含10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)、2mM/

2、L谷氨酰胺、100單位/ml青霉素、100單位/ml鏈霉素、100單位/ml慶大霉素的杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)保存和傳代。培養(yǎng)至第7-9代用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞重懸于DMEM中，接種到纖維連接蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）包被的培養(yǎng)板中，按各組的實(shí)驗(yàn)要求干預(yù)、培養(yǎng)、裂解細(xì)胞，收集全細(xì)胞裂解液備用,或者行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。
　　1.2、免疫印跡實(shí)驗(yàn)(West

3、ern blot,WB)檢測(cè)FAK的激活率，Western blot結(jié)合免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)整合素β1是否與FAK結(jié)合，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定HLFs在FN上的遷移功能。
　　2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　2.1、8-11周齡C57BL/6小鼠分4組：正常對(duì)照組，PF-573228對(duì)照組，博萊霉素（Bleo）組，PF-573228干預(yù)組。小鼠被麻醉后，以Bleo(3 U/公斤體重，只小

4、鼠的劑量用生理鹽水配至50μl)或生理鹽水(50μl/只)緩慢經(jīng)氣管注射。隨后正常對(duì)照組和Bleo組每日經(jīng)腹腔注射0.2ml生理鹽水，PF-573228對(duì)照組和PF-573228干預(yù)組每日經(jīng)腹腔注射PF-573228（50mg/kg，每只小鼠的劑量用生理鹽水配至0.2ml）。21天后獲取小鼠肺組織，肺組織用于病理學(xué)、蛋白組學(xué)檢查及檢測(cè)全肺羥脯氨酸。
　　2.2、肺病理組織標(biāo)本HE(Hematoxylin-Eosin,HE)染色用于

5、阿什克羅夫特(Ashcroft)評(píng)分，全肺組織檢測(cè)羥脯氨酸含量，Western blot檢測(cè)FN、Ⅰ型前膠原蛋白（Procollagen TppeⅠ Protein,Pro-Col1）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-Smooth Muscle Actin，α-SMA）評(píng)價(jià)肺纖維化的程度；Western blot檢測(cè)Rac、FAK的激活率和S100A4表達(dá)，評(píng)價(jià)肺組織中肺成纖維細(xì)胞的遷移程度。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)

6、準(zhǔn)差表示，并使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析(用于兩組間的比較)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重復(fù)三至四次，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M包含5到6只動(dòng)物，重復(fù)兩次，p<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.血小板衍生生長(zhǎng)因子(Platelet-derived Growth Factor-BB,PDGF-BB)誘導(dǎo)HLFs過程中調(diào)節(jié)FAK激活及調(diào)節(jié)FAK與整合素β1結(jié)合的機(jī)制
　　PDGF-BB誘導(dǎo) FAK激活呈雙峰樣改變，第一

7、個(gè)是較低的峰值PDGF-BB的濃度在0.1-0.5 ng/ml的范圍，第二個(gè)是最高峰值PDGF-BB的濃度在1-5 ng/ml的范圍。給予2ng/mlPDGF-BB誘導(dǎo)HLFs時(shí)，F(xiàn)AK激活最早發(fā)生在誘導(dǎo)后的6分鐘。FAK早期有一定幅度的激活發(fā)生在PDGF-BB誘導(dǎo)后的30分鐘。隨后FAK激活有下降趨勢(shì)，但于PDGF-BB誘導(dǎo)后5小時(shí)FAK激活再逐步增加，并于PDGF-BB誘導(dǎo)后20小時(shí)達(dá)到頂峰。PDGF-BB以劑量依賴性的方式誘導(dǎo)HL

8、Fs遷移。在HLFs培養(yǎng)過程中，如果沒有PDGF-BB的誘導(dǎo)FAK與整合素β1無關(guān)聯(lián)(圖2-7)。在PDGF-BB誘導(dǎo)下，F(xiàn)AK與整合素β1直接結(jié)合，這種結(jié)合在PDGF-BB誘導(dǎo)10個(gè)小時(shí)達(dá)到高峰。
　　2.FAK抑制劑對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)HLFs遷移，及對(duì)FAK與整合素β1結(jié)合的影響
　　PDGF-BB誘導(dǎo)遷移率(每24小時(shí)傷口覆蓋區(qū)域)與其被使用的劑量呈正相關(guān),誘導(dǎo)遷移率最高的PDGF-BB范圍為1-5 ng/ml。PD

9、GF-BB誘導(dǎo)HLFs遷移也是時(shí)間依賴的方式。PDGF誘導(dǎo)5個(gè)小時(shí)和24小時(shí)后遷移率分別顯著增加（P＜0.01）。PF-573228抑制PDGF-BB誘導(dǎo) FAK激活(pY397 of FAK)和抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的HLFs遷移的劑量依賴性的方式。給予FAK抑制劑并沒有阻止FAK與整合素β1結(jié)合，PF-573228即使在能有效地抑制PDGF-BB誘導(dǎo)FAK激活和HLFs遷移的劑量(1或5μM)下仍沒有影響FAK-整合素β1結(jié)。

10、>　　3.整合素β1在FAK激活和FAK調(diào)控HLFs遷移中的功能
　　與對(duì)照免疫球蛋白組相比，整合素β1抑制性抗體減少約85%的遷移（p<0.001)。整合素α5或α4抑制性抗體抑制約50%的HLFs在FN上遷移。阻斷整合素α vβ3、α vβ6或α vβ8，各抑制HLFs在FN上約5%的遷移。整合素β1抑制性抗體明顯阻斷PDGF-BB-誘導(dǎo)的 FAK的激活。當(dāng)HLFs接種到FN上沒有PDGF-BB誘導(dǎo)時(shí)，整合素β1抑制性抗體或?qū)?/p>

11、照免疫球蛋白G組沒有影響FAK基本的激活。整合素β1阻斷抗體中斷了PDGF-BB誘導(dǎo)HLFs中FAK與整合素β1聯(lián)系。
　　4.FAK抑制劑PF-573228對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的干預(yù)效果及機(jī)制研究肺組織的形態(tài)學(xué)分析揭示FAK抑制劑干預(yù)組與Bleo組相比Ashcroft肺纖維化評(píng)分大約下降1.2分(p<0.01)。檢測(cè)羥脯氨酸替代總膠原蛋白在整個(gè)肺組織含量，F(xiàn)AK抑制劑干預(yù)組較 Bleo組總膠原蛋白水平顯著降低(p<0.01

12、)。FAK抑制劑干預(yù)組與Bleo組相比，F(xiàn)AK抑制劑顯著抑制FAK和Rac激活，和顯著降低S100A4表達(dá),顯著降低整個(gè)肺FN和Pro-Col1含量，顯著降低肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.PDGF-BB以劑量依賴和時(shí)間依賴的方式激活FAK，并且使FAK被招募后直接與整合素β1結(jié)合。
　　2.FAK抑制劑PF-573228以劑量依賴和時(shí)間依賴的方式抑制PDGF-BB誘導(dǎo)FAK的激活，并可能通

13、過此機(jī)制抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的HLFs遷移。FAK與整合素β1相結(jié)合可能為FAK激活的上游信號(hào)。
　　3.整合素β1在PDGF-BB誘導(dǎo)人肺HLFs遷移過程中發(fā)揮主要作用，整合素β1粘附在FN上對(duì)FAK和整合素β1結(jié)合，以及對(duì)隨后PDGF-BB誘導(dǎo)FAK的激活都是必不可少的。
　　4.FAK抑制劑通過抑制HLFs的遷移、抑制細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)蛋白質(zhì)產(chǎn)生、抑制肌HLFs的分化，從而