分化型甲狀腺癌的靶向治療研究.pdf

1、第一部分：整合素αvβ3/αvβ5受體拮抗治療失分化甲狀腺癌的實驗研究
　　目的：乳頭狀甲狀腺癌（Papillary Thyroid Cancer，PTC）患者常常預(yù)后較好，但是其疾病復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移并不少見。部分PTC患者因其病灶攝取放射性碘（Radioactive Iodine,RAI）的能力差或者完全不能攝取放射性碘，不宜進行RAI治療，預(yù)后相對較差。尋找有效的靶點對這部分患者進行治療顯得非常有必要。整合素在腫瘤的多種生物學(xué)行為中

2、均發(fā)揮著重要的作用，本研究中我們檢測了整合素α vβ3及α vβ5受體在PTC細胞株中的表達，并分析了整合素阻斷治療對PTC細胞及動物模型的抗腫瘤效果。
　　方法：首先我們通過熒光激活細胞分選術(shù)檢測了西倫吉肽的作用靶點，整合素αvβ3及α vβ5在三種PTC細胞株(BCPAP、K1及TPC1)中的表達情況，并用熒光染色的方法進一步直觀的驗證了整合素α vβ3及α vβ5在PTC細胞株中的表達。隨后，我們通過細胞計數(shù)試劑盒（Cell

3、 Counting Kit-8，CCK-8）及流式細胞分選術(shù)對藥物作用下細胞的增殖及凋亡進行了評估；并通過Transwell的方法分析了整合素阻斷對細胞的遷移及侵襲能力的影響。通過給裸鼠皮下注射K1細胞我們建立了小鼠甲狀腺癌異位種植模型。在小鼠給藥期間，我們通過測量腫瘤的長短徑大小監(jiān)測腫瘤的生長，并通過免疫組化染色腫瘤切片的方法評估了腫瘤出血壞死情況、微血管密度變化及腫瘤細胞凋亡的程度。
　　結(jié)果：我們觀察到三種PTC細胞均存在整

4、合素α vβ3及α vβ5的表達，TPC1細胞中整合素α vβ3及α vβ5的表達最高（分別為69.3±7.4%及52.8±1.8%）（P<0.05），而在BCPAP及K1細胞中，整合素α vβ3及α vβ5的表達水平中等（BCPAP:35.1±2.3%及41.9±3.2%，K1:37.7±2.3%及48.0±1.4%)（P≤0.05)）。通過西倫吉肽阻斷整合素α vβ3及α vβ5的受體活性后，三種細胞均從培養(yǎng)瓶底部脫離，細胞的增殖速

5、率也均受到明顯抑制。與BCPAP及K1細胞相比，藥物作用后TPC1細胞增殖受抑制最為明顯，其細胞凋亡率達到37.8%（BCPAP及K1細胞分別為6.67%和9.43%）。Transwell實驗結(jié)果顯示整合素α vβ3及α vβ5受體活性被阻斷后，三種PTC細胞的遷移及侵襲能力均受到顯著抑制(P≤0.05)。動物實驗中，50mg/kg/天的劑量持續(xù)作用10天未發(fā)現(xiàn)小鼠腫瘤生長受到抑制，然而腫瘤的免疫組化染色結(jié)果顯示與對照組小鼠腫瘤相比，藥

6、物組小鼠腫瘤出血壞死明顯，微血管密度明顯降低，腫瘤細胞凋亡增多(P≤0.05)。
　　結(jié)論：本研究證實了PTC細胞株上存在整合素α vβ3及α vβ5的表達。通過西倫吉肽阻斷整合素α vβ3及α vβ5受體活性后，細胞凋亡增加，細胞的增殖、遷移及侵襲能力均受到顯著抑制。體內(nèi)實驗則顯示西倫吉肽可抑制腫瘤的新生血管生成并促進腫瘤細胞凋亡，但是該抑制效應(yīng)尚未表現(xiàn)為腫瘤體積的縮小。
　　實驗中，50mg/kg/天的劑量持續(xù)作用10天

7、未發(fā)現(xiàn)小鼠腫瘤生長受到抑制，然而腫瘤的免疫組化染色結(jié)果顯示與對照組小鼠腫瘤相比，藥物組小鼠腫瘤出血壞死明顯，微血管密度明顯降低，腫瘤細胞凋亡增多(P≤0.05)。
　　結(jié)論：本研究證實了PTC細胞株上存在整合素α vβ3及α vβ5的表達。通過西倫吉肽阻斷整合素α vβ3及α vβ5受體活性后，細胞凋亡增加，細胞的增殖、遷移及侵襲能力均受到顯著抑制。體內(nèi)實驗則顯示西倫吉肽可抑制腫瘤的新生血管生成并促進腫瘤細胞凋亡，但是該抑制效應(yīng)尚

8、未表現(xiàn)為腫瘤體積的縮小。
　　第二部分：18F-AIF-NOTA-PRGD2顯像在分化型甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的應(yīng)用價值
　　目的：整合素α vβ3顯像已被廣泛應(yīng)用于臨床及臨床前期研究中，但是尚未有研究報道其與18F-FDG相比在診斷腫瘤、監(jiān)測治療療效方面的價值。在本研究中，我們將一種新的整合素α vβ3顯像劑18F-AIF-NOTA-PRGD2應(yīng)用于存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者，分析其與18F-FDG相比在診斷病灶、評估病

9、灶整合素表達方面的價值。
　　方法：20位存在可疑淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分化型甲狀腺癌患者（Differentiated Thyroid Cancer，DTC）被納入該研究，分別進行18F-AIF-NOTA-PRGD2 PET/CT顯像及18F-FDG PET/CT顯像。16位受檢者進行了超聲引導(dǎo)下頸部淋巴結(jié)細針穿刺術(shù)（Fine Needle Aspiration Biopsy，F(xiàn)NAB）,病灶的病理結(jié)果作為判斷病灶良惡性的金標準；4位受檢

10、者不同意接受FNAB，其病灶的良惡性根據(jù)其臨床隨訪結(jié)果及其他臨床檢查如頸部超聲、血清TG、TG抗體濃度進行判斷。
　　結(jié)果：20位受檢者經(jīng)影像學(xué)檢查（頸部超聲、CT等）共發(fā)現(xiàn)39個可疑淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，經(jīng)病理結(jié)果及臨床隨訪證實其中35個病灶為惡性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。放射性碘難治性（Radioactive Iodine Refractory，RAIR）病灶與良性病灶的18F-AIF-NOTA-PRGD2 SUV值分別為2.5±0.9和2.8±

11、0.9，而18F-FDG SUV值分別為4.5±1.6和3.3±1.2。惡性病灶對18F-FDG的攝取顯著高于其對18F-AIF-NOTA-PRGD2的攝?。≒<0.05）。病灶對兩種顯像劑的攝取未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性（r=0.114，P=0.515）。此外，15個直徑大于1.5cm的病灶對18F-AIF-NOTA-PRGD2的攝取高于直徑小于1.5cm的病灶對顯像劑的攝取。
　　結(jié)論：盡管DTC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶對顯像劑18F-AIF-N

12、OTA-PRGD2的攝取顯著高于周圍正常組織，它在診斷病灶方面的價值劣于18F-FDG。病灶對18F-AIF-NOTA-PRGD2和18F-FDG的攝取不存在相關(guān)性，這意味著18F-FDG在診斷RAIR DTC病灶方面存在優(yōu)勢，而18F-AIF-NOTA-PRGD2在評估病灶整合素表達及監(jiān)測抗血管治療療效方面存在價值。
　　第三部分：BRAF抑制劑聯(lián)合HDAC抑制劑對甲狀腺癌細胞株攝碘基因表達及攝碘能力的影響
　　目的：使用

13、BRAFV600E抑制劑恢復(fù)碘難治性（Radioactive Iodine Refractory，RAIR)甲狀腺癌攝碘基因的表達及對放射性碘的攝取能力使其重新能夠攝取 RAI已經(jīng)成為一種新的治療 RAIR甲癌的策略，然而近期的臨床研究表示單獨使用BRAFV600E抑制劑恢復(fù)RAIR甲癌攝碘基因表達及攝碘能力的效果有限?？紤]到NIS啟動子區(qū)去乙?；福℉istone Deacetylase，HDAC）促進組蛋白去乙?；荁RAFV600

14、E沉默 NIS基因表達的機制之一，我們認為同時抑制 BRAFV600E及HDAC或許能更有效的促進RAIR甲癌攝碘基因的表達及攝碘能力的增加。
　　方法：我們將兩種已被批準用于臨床腫瘤治療的藥物 PLX4032（維羅非尼）和HDAC抑制劑（伏立諾他）用于甲狀腺癌細胞株，利用實時熒光定量PCR檢測其攝碘基因的mRNA表達情況、免疫熒光染色法定位鈉碘轉(zhuǎn)運體（Sodium Iodine Symporter，NIS）的表達情況及攝碘功能試

15、驗評估其對RAI的攝取能力。
　　結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn) PLX4032單獨作用于甲狀腺細胞株時可選擇性得促進含有BRAFV600E突變的細胞株攝碘基因的表達及攝碘功能的增加。SAHA作為HDAC抑制劑可使所有細胞株的攝碘相關(guān)基因的表達均增加并相應(yīng)得改善細胞株的攝碘能力。在含有BRAFV600E突變的細胞株中，PLX4032聯(lián)合SAHA可協(xié)同促進攝碘基因的表達及攝碘功能的增加，TSH刺激則能進一步放大這種協(xié)同作用。在 BRAF野生型細胞株