Celf1在模擬強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良RNA毒性致成肌分化缺陷中的部分調(diào)節(jié)作用.pdf

1、分類號：分類號：密級：密級：UDC：學(xué)號：學(xué)號：T10411201301008南昌大學(xué)專業(yè)學(xué)位博士研究生學(xué)位論文Celf1在模擬模擬強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良RNA毒性致成肌分化毒性致成肌分化缺陷中的部分調(diào)節(jié)作用缺陷中的部分調(diào)節(jié)作用Celf1ispartiallyresponsiblefdefectivemyoblastdifferentiationinmyotonicdystrophyimitatedRNAtoxicity彭小平

2、彭小平培養(yǎng)單位（院、系）：南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院培養(yǎng)單位（院、系）：南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院指導(dǎo)教師姓名、職稱：指導(dǎo)教師姓名、職稱：王夢洪王夢洪教授教授專業(yè)學(xué)位種專業(yè)學(xué)位種類：類：臨床臨床醫(yī)學(xué)醫(yī)學(xué)專業(yè)領(lǐng)域名稱專業(yè)領(lǐng)域名稱：內(nèi)科內(nèi)科學(xué)論文答辯日期：論文答辯日期：2016年5月答辯委員會主席：答辯委員會主席：評閱人：評閱人：2016年5月摘要II摘要目的：目的：研究Celf1對模擬強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良RNA毒性致成肌分化缺陷中的部分調(diào)節(jié)作用。方法方法

3、：1、C2C12成肌細(xì)胞培養(yǎng)與分化，并進(jìn)行成肌分化誘導(dǎo)。于0，1，2，4，6時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行樣品收集。2、質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染，構(gòu)建GFPCUG5和GFPCUG200質(zhì)粒，構(gòu)建后利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入C2C12細(xì)胞中；構(gòu)建pMSCVCelf1Flagpuro質(zhì)粒，將Bayl醫(yī)學(xué)院TomCooper提供pcDNA3Celf1Flag質(zhì)粒中含有Celf1Flag的EcI片段插入pMSCVpuro質(zhì)粒，將質(zhì)粒用293T細(xì)胞包裝制備逆轉(zhuǎn)錄病毒，隨后轉(zhuǎn)染C2C12

4、細(xì)胞；Celf1shRNA慢病毒載體和對照組ScrambledshRNA病毒由20μgshRNA編碼的慢病毒載體和150μg包裝載體psPAX2以及10μg包膜載體pMD2.G共同轉(zhuǎn)染入150mm培養(yǎng)皿的293T細(xì)胞中收集上清轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞。3、抗體與免疫測定，westernblot測定按常規(guī)方法將轉(zhuǎn)膜蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。先后用Celf1單克隆鼠抗FlagActin一抗孵育及辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG二抗進(jìn)行孵育，增強(qiáng)熒

5、光試劑顯色。4、實(shí)時(shí)定量RT?PCR及RT?PCR選擇性剪切分析以GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)對照，測定MyoD(Myf3)、Myogenin(MyoG)、Mef2c、Celf1等基因在成肌分化中的變化。提取總RNA，使用特異性引物擴(kuò)增Zasp、MBNL1、ZTTN、MTTN、和BIN1，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂凝膠分，DNA條帶利用ImageJ軟件進(jìn)行分析。5、流式細(xì)胞術(shù)及熒光激活細(xì)胞分選（FACS）測定成肌細(xì)胞增殖及早期分化的細(xì)胞周期分布，用胰蛋