磷酸三(2,3-二氯丙基)酯暴露誘發(fā)NRK-52E細胞纖維化的體外研究.pdf

1、自2004年禁止使用五溴聯(lián)苯醚混合物阻燃劑以來，有機磷阻燃劑(organophosphorus flame retardants,OPFR)作為替代品開始被廣泛生產(chǎn)和使用。有機磷阻燃劑在水體環(huán)境及生物體中的檢出率越來越高，而其對生物體及生態(tài)環(huán)境的潛在毒性效應還知之甚少。
　　對于處于食物鏈頂端的水生哺乳動物如中華白海豚而言，腎臟對于其正常生理活動具有重要的意義，不僅可以維持水、酸堿及電解質平衡，還具有內分泌功能，可清除體內代謝廢物

2、及外界毒物，因此研究有機磷阻燃劑對水生哺乳動物腎臟的毒理效應，對于評估阻燃劑的環(huán)境效應具有重要的意義。鑒于目前無法在中華白海豚體內進行活體實驗，也未有成熟的中華白海豚腎臟細胞系，所以我們選有陸生代表性哺乳動物大鼠的腎小管上皮細胞作為我們實驗的研究對象。
　　本研究利用磷酸三(2,3-二氯丙基)酯(tri(2,3-dichloropropyl)phosphate, TDCPP)對大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)的毒性暴露實驗，研

3、究TDCPP對細胞活性及基因表達變化情況，來探討TDCPP是否具有引起腎小管上皮細胞發(fā)生上皮間充質轉換(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的生物毒性，進而對環(huán)境保護工作提供基本的實驗數(shù)據(jù)。
　　研究結果表明：
　　1、TDCPP影響NRK-52E細胞的形態(tài)，如使細胞變圓，染色質發(fā)生固縮；抑制細胞活性，細胞活性檢測實驗結果表明，NRK-52E細胞經(jīng)TDCPP暴露處理12、24、36、4

4、8、60、72h后，TDCPP對細胞活性的有效半數(shù)抑制濃度IC50分別為60.58、25.72、17.20、6.55、4.64、1.78μM，隨著TDCPP對NRK-52細胞作用時間的延長，IC50不斷降低；
　　2、TDCPP可以誘導NRK-52E細胞內活性氧自由基生成量增加，形成氧化應激反應，破壞細胞原有的活性氧自由基生成與清除之間的平衡狀態(tài)。過量的活性氧可以通過絲裂原活化蛋白激酶信號通路和c-Jun氨基末端激酶信號通路誘導下

5、游轉化生長因子-β1的生成，促進細胞外基質成分的過度積累，進而導致纖維化；
　　3、50μM TDCPP暴露處理72h，NRK-52E細胞轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）mRNA的誘導表達量是空白對照組的149％，而對TGF-β1受體mRNA的誘導量是空白對照組的246%。TGF-β1不僅可以誘導細胞凋亡過程的發(fā)生，還可以活化處于靜止狀態(tài)的間充質成纖維細胞，促進上皮細胞

6、向肌成纖維細胞的分化過程，通過與其膜受體結合，通過TGF-β/SMAD信號通路誘導上皮-間充質轉換，促進纖維化發(fā)生；
　　4、TDCPP可以誘導上皮細胞發(fā)生上皮-間充質轉換，TDCPP抑制在上皮細胞中起粘附作用的上皮細胞鈣粘蛋白及緊密連接蛋白-1（fibronectin-1,FN-1） mRNA的表達量，50μM TDCPP在六個時間階段內的暴露處理對上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）mRNA的表達都有顯著的抑制效果，平均僅為空

7、白對照組的22.7%，50μM TDCPP暴露處理72h后緊密連接蛋白（zonula occludens-1, ZO-1）mRNA的表達量為空白對照組的50.7%；對于間充質波形蛋白的mRNA而言，50μM TDCPP暴露處理72h后的表達量為空白對照組的301%。上皮-間充質轉換過程中生成大量的間充質細胞，使纖維化過程加重；
　　5、50μM TDCPP暴露處理72h后α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle acti

8、n,α-SMA）的表達量為空白對照組的133%；α-SMA是肌成纖維細胞的標志分子，其表達上調，表明肌成纖維細胞被活化，進一步產(chǎn)生纖維化細胞。
　　6、TDCPP還可以破壞胞外基質的穩(wěn)定性，誘導FN-1 mRNA的表達量，促進其過度沉積，導致纖維化的發(fā)生；同時，幾乎完全抑制了Ⅰ型膠原蛋白（collagen1,Col1）和Ⅲ型膠原蛋白（collagen3,Col3）mRNA的表達，破壞了細胞之間的緊密連接和穩(wěn)定的微環(huán)境。