HuMSCs對不育小鼠生殖細胞、支持細胞和間質(zhì)細胞生長的調(diào)控研究.pdf

1、【背景與目的】：近數(shù)十年來，男性不育越來越為人們所關(guān)注，雖然男性不育的診斷、藥物治療及社會管理等方面在不斷進步，尤其是輔助生殖技術(shù)的成熟推廣，許多患者圓了自己的生育夢。但前提是這些不育患者必須能夠產(chǎn)生具有一定數(shù)量并且有功能的生殖細胞，而對于那些不能產(chǎn)生具有正常功能的生殖細胞或健全的單倍體精子的不育患者，干細胞移植治療是其理想選擇。我們的前期研究表明，HUMSCs在體外能夠向生殖細胞誘導分化，移植到不育小鼠體內(nèi)后能夠分化表達生殖細胞標記，

2、能夠促進不育小鼠睪丸組織修復。本研究旨在前期研究基礎(chǔ)上，進一步探討人臍帶間充質(zhì)干細胞移植對不育小鼠睪丸生殖細胞、支持細胞及間質(zhì)細胞的作用。
　　【材料與方法】：（1）采用組織塊貼壁法分離、培養(yǎng)、擴增HUMSCs；（2）采用腹腔內(nèi)單次注射白消安的方法構(gòu)建不育小鼠模型；（3）通過顯微注射法將 HUMSCs移植到不育小鼠睪丸曲細精管內(nèi)，移植后常規(guī)飼養(yǎng)；（4）分別于移植后第1周、2周、1月、2月解剖收取小鼠睪丸；（5）采用組織病理切片和免

3、疫熒光顯微鏡下觀察的方法來觀察 HuMSCs在曲細精管內(nèi)的存活、分布及分化情況，qRT-PCR檢測生殖細胞、SCs、LCs特異性標記在睪丸組織中的表達情況。
　　【結(jié)果】：（1）采用組織塊貼壁法，用無血清培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)、擴增HUMSCs能正常生長2個月以上；（2）腹腔內(nèi)單次注射白消安4周后，小鼠睪丸體積明顯縮小，包膜松弛，管腔變小、質(zhì)脆，鏡下見生精上皮損傷，生精細胞脫落，絕大部分管腔呈“空泡樣”改變，不育小鼠模型構(gòu)建成功；（3）

4、通過顯微注射法成功將細胞移植到小鼠睪丸曲細精管，移植1周后HuMSCs主要存在于睪丸曲細精管的官腔內(nèi)，且有逐漸向基底膜移行的趨勢，1月后即可觀察到細胞分布在生精上皮近基底膜處，2月時定植于基底膜；（4）不育小鼠移植HUMSCs后，大體觀下睪丸體積較陰性對照增大（p<0.05），鏡下見生殖細胞增生恢復加快；（5）qRT-PCR結(jié)果顯示，HUMSCs移植后1、2月，HUMSCs移植組生殖細胞標記Ddx4表達水平明顯升高，與陰性對照組有顯著性

5、差異（p<0.05）；移植后不成熟SCs標記Amh的表達水平明顯升高，與陰性對照組有顯著性差異（p<0.05）；移植后1、2周、1月，成熟SCs標記Ar的表達水平明顯升高，與陰性對照組有顯著性差異（p<0.05）,2月時無明顯差異（p>0.05）；fetal LCs標記Lhcgr在移植后1、2周時較陰性對照組明顯升高（p<0.05），1、2月時則降低（p<0.05）；adult LCs標記Hsd-3b1在移植后1、2周時較陰性對照組明顯

6、升高（p<0.05），1月時降低（p<0.05），2月時無明顯差異（p>0.05）。
　　【結(jié)論】：（1）采用無血清培養(yǎng)體系，運用組織塊貼壁法，HuMSCs體外擴增培養(yǎng)能正常生長至少2個月；（2）HUMSCs移植不育小鼠曲細精管后能夠存活并發(fā)生遷移，1月后分布在生精上皮近基底膜處，2月時定植于基底膜；（3）HUMSCs對不育小鼠生殖細胞生長有促進作用，并持續(xù)增強；（4）HUMSCs對支持細胞的生長有促進作用，但2周后逐漸減弱；（5