功夫菊酯通過干擾BDNF通路抑制雌激素促海馬PSD95表達(dá)的研究.pdf

1、研究背景：
　　功夫菊酯（lambda-cyhalothrin，LCT）是目前被廣泛應(yīng)用的一種II型擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，具有神經(jīng)毒性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)對于行卵巢切除的青春期小鼠， LCT或雌激素（17β-Estradiol, E2）均能夠提高小鼠海馬突觸后致密蛋白95（Post-synaptic Density95, PSD95）的蛋白表達(dá)且改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，而當(dāng)LCT與E2共同作用時，各自的單獨(dú)效應(yīng)均不顯示。前期在培養(yǎng)原

2、代小鼠海馬神經(jīng)元的研究中發(fā)現(xiàn)，雌激素受體α（Estrogen Receptorα, ERα）介導(dǎo)的AKT通路在LCT抑制雌激素的促神經(jīng)突起生長（表現(xiàn)為數(shù)目增加）和促PSD95表達(dá)中起重要作用。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain Derived Neurotrophic Factor, BDNF）可調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活和生長以及突觸發(fā)育，是E2神經(jīng)保護(hù)的重要效應(yīng)分子。BDNF的表達(dá)受 ERα-AKT、MAPK及 PKA等多條信號通路調(diào)控。LCT雖

3、然可干擾 ERα-AKT通路，但并非必然影響B(tài)DNF。本課題擬探討B(tài)DNF通路是否參與到LCT干擾雌激素的神經(jīng)發(fā)育效應(yīng)中。
　　目的：以小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞系HT22細(xì)胞為體外模型，和行卵巢切除術(shù)ICR雌鼠為體內(nèi)模型，研究BDNF通路在功夫菊酯（LCT）干擾雌激素促海馬PSD95表達(dá)以及促海馬功能中的作用。
　　方法：以小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞系HT22細(xì)胞為模型，用LCT（50μM）、E2（10 nM）、LCT（50μM）+TrkB

4、FC（BDNF信號通路的抑制劑,20μg/ml）、E2（10 nM）+TrkB FC（20μg/ml）、LCT（50μM）+ICI182780（ERα抑制劑，1μM）、E2（10 nM）+ICI182780（1μM）、LCT（50μM）+E2（10 nM）處理24h，MTT法檢測細(xì)胞活性，免疫蛋白印跡法檢測PSD95蛋白表達(dá)，ELISA法檢測培養(yǎng)上清和細(xì)胞的BDNF蛋白水平。對出生后28天（PND28）的雌鼠行卵巢切除術(shù)（OVX），恢復(fù)

5、7天后，隨機(jī)分為8組，每組10只，分別為：OVX+DMSO，OVX+LCT(3.0μg/g)，OVX+E2(10.0μg/g),OVX+LCT(3.0μg/g)+K252a(BDNF信號通路的抑制劑,25μg/kg),OVX+ E2(10.0μg/g)+K252a(25μg/kg),OVX+LCT(3.0μg/g)+E2(10.0μg/g)，Sham+DMSO， Sham+LCT(3.0μg/g)。腹腔注射給藥，每天一次，連續(xù)7天，末次

6、給藥24小時后,各組中隨機(jī)抽取5只小鼠進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)（曠場實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮），余下部分用于免疫蛋白印跡法檢測PSD95蛋白表達(dá)，ELISA法檢測海馬中BDNF蛋白水平。
　　結(jié)果：在HT22細(xì)胞系體外培養(yǎng)模型中，發(fā)現(xiàn)LCT處理HT22細(xì)胞24h后，出現(xiàn)類似E2作用的效應(yīng)。LCT顯著提高HT22細(xì)胞PSD95蛋白的表達(dá)，用ICI182780后這種增強(qiáng)效應(yīng)消失。且LCT處理組與E2處理組之間細(xì)胞PSD95表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示

7、LCT因其擬雌激素特性影響神經(jīng)元PSD95表達(dá)。ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)，各處理組HT22細(xì)胞內(nèi)BDNF蛋白水平無明顯改變，而培養(yǎng)上清中BDNF蛋白有明顯差異，提示BDNF蛋白表達(dá)受到影響。對BDNF mRNA的檢測結(jié)果與培養(yǎng)上清ELISA法檢測結(jié)果一致，說明LCT及其與E2聯(lián)合作用可影響B(tài)DNF表達(dá)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LCT具有類似E2的促BDNF表達(dá)效應(yīng)，且可被ERα的經(jīng)典核受體抑制劑ICI182780所阻斷。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，LCT或E2對神經(jīng)元P

8、SD95表達(dá)的促進(jìn)效應(yīng)均可被BDNF受體抑制劑TrkB FC所抑制，說明BDNF在LCT和E2對PSD95表達(dá)的影響中起到重要作用。ERα抑制劑和BDNF受體抑制劑對E2或LCT促PSD95表達(dá)效應(yīng)的影響之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，進(jìn)一步說明 BDNF通路在雌激素神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)以及LCT干擾雌激素的這種效應(yīng)中起重要作用。
　　在ICR雌鼠OVX模型中同樣發(fā)現(xiàn)類似體外模型的效應(yīng)，OVX處理顯著降低海馬PSD95和BDNF的蛋白表達(dá)，OVX+D

9、MSO組與Sham+DMSO組相比，海馬PSD95和BDNF蛋白水平明顯下降，而補(bǔ)充雌激素后這種降低效應(yīng)得以改善，OVX+E2組與Sham+DMSO組相比無顯著差異；OVX+E2組與OVX+DMSO組相比，海馬PSD95和BDNF蛋白明顯升高。與雌激素作用相似，LCT能夠顯著提高海馬PSD95和BDNF蛋白表達(dá)，OVX+LCT組與OVX+DMSO組相比，海馬PSD95和BDNF蛋白水平明顯增加；OVX+LCT組與OVX+E2組相比，海馬

10、PSD95和BDNF蛋白水平無明顯差異。而BDNF受體TrkB的抑制劑K252a可抑制LCT和E2對海馬PSD95的促進(jìn)作用，也進(jìn)一步證明BDNF在LCT和E2對PSD95表達(dá)的影響中起到重要作用。LCT能夠明顯干擾E2對PSD95和BDNF的促進(jìn)作用，OVX+LCT+E2組與OVX+E2組、Sham+LCT組與Sham+DMSO組相比，海馬PSD95和BDNF的蛋白水平明顯降低。
　　在曠場實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)OVX處理顯著減少小鼠的自主

11、運(yùn)動能力，OVX+DMSO組與Sham+DMSO組相比穿越總格數(shù)減少，而補(bǔ)充雌激素后這種降低效應(yīng)消失， OVX+E2組與Sham+DMSO組相比無顯著差異，OVX+ E2組與OVX+DMSO組相比穿越總格數(shù)明顯增加。這充分說明雌激素能夠改善小鼠的自主運(yùn)動能力；與雌激素作用相似，LCT單獨(dú)作用能夠顯著增加穿越總格數(shù)，OVX+LCT組與OVX+DMSO組相比穿越總格數(shù)明顯增長，OVX+LCT組與OVX+E2組相比穿越總格數(shù)無明顯差異，這說明

12、LCT單獨(dú)作用時對小鼠的自主運(yùn)動能力表現(xiàn)出擬雌激素效應(yīng)；而BDNF受體TrkB的抑制劑K252a能夠抑制LCT和E2的單獨(dú)效應(yīng)，OVX+LCT+K252a組與OVX+LCT組相比、OVX+E2+K252a組與OVX+ E2組相比穿越總格數(shù)明顯減少， BDNF通路在雌激素維持小鼠正常行為以及LCT干擾雌激素的這種效應(yīng)中起重要作用。在存在雌激素的狀態(tài)下， LCT能夠明顯干擾E2對穿越總格數(shù)的影響， OVX+LCT+E2組與OVX+E2組、S

13、ham+LCT組與Sham+DMSO組相比穿越總格數(shù)明顯減少。
　　同樣，在水迷宮實(shí)驗(yàn)中OVX處理顯著延長登臺潛伏期和縮短在目標(biāo)象限的時間，OVX+DMSO組與 Sham+DMSO組相比登臺潛伏期明顯延長，在目標(biāo)象限的時間明顯縮短，而補(bǔ)充雌激素后上述效應(yīng)消失；與雌激素作用相似，LCT單獨(dú)作用能夠顯著縮短登臺潛伏期時間和延長在目標(biāo)象限的時間； BDNF受體TrkB的抑制劑K252a能夠抑制LCT和E2的單獨(dú)效應(yīng)，LCT+K252a組

14、與OVX+LCT組、E2+K252a組與OVX+E2組相比登臺潛伏期明顯延長，目標(biāo)象限的時間明顯縮短；LCT能夠明顯干擾E2對登臺潛伏期和目標(biāo)象限時間的影響，OVX+LCT+ E2組與OVX+E2組、Sham+LCT組與Sham+DMSO組相比登臺潛伏期明顯延長，在目標(biāo)象限的時間明顯縮短。
　　結(jié)論：BDNF通路在E2促進(jìn)神經(jīng)元PSD95表達(dá)中起重要作用，雖然LCT單獨(dú)作用時具有擬E2的效應(yīng)，但LCT可通過干擾BDNF通路抑制E2