Smad泛素化調節(jié)因子2在TGFβ1誘導人肺成纖維細胞活化中的作用及其分子機制.pdf

1、肺纖維化是以成纖維細胞過度增殖、活化、細胞外基質（extracelluar matrix，ECM）沉積，并伴有炎癥和損傷所致組織結構破壞和功能喪失為共同病理特征的一組彌漫性肺疾病。轉化生長因子β1(Transforming growth factorβ1，TGF-β1)是一種多功能的細胞因子，也是迄今為止最強的致纖維化因子。Smad信號通路是TGF-β超家族成員通過胞膜上的特異性受體將信號傳遞至核內的主要的、中樞性的傳遞分子。TGF-β

2、1/Smads信號轉導通路在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中，具有關鍵而重要的作用，包括趨化和活化炎性細胞，介導肺泡上皮細胞向間充質細胞轉分化，促進成纖維細胞活化、增殖，以及刺激細胞外基質蛋白的合成及促進其沉積。
　　泛素-蛋白酶體通路（Ubiquitin Proteasome Pathway，UPP）是一個調節(jié)蛋白質降解與功能的重要系統(tǒng)，在細胞內普遍存在，參與細胞凋亡、細胞周期調控、細胞信號轉導、抗原提呈等多種生理過程，對維持細胞的穩(wěn)態(tài)具有

3、十分重要的意義，其功能的改變和異常能直接導致或誘發(fā)人類的許多重要疾病。UPP中E3泛素連接酶促使泛素和特異性蛋白相結合，使靶蛋白泛素化降解，決定了降解底物蛋白的特異性和高度選擇性，因此在UPP中起著決定性作用。Smad泛素化調節(jié)因子（Smad ubiquitination regulatory factor，Smurf）是一種含HECT結構域的E3泛素連接酶，包括Smurf1和Smurf2。
　　Smurfs通過選擇性介導Smad

4、信號轉導通路中關鍵組分的降解，從而在TGF-β1信號活性的調節(jié)中起樞紐作用，一旦功能失調，會導致異常的TGF-β1/Smads信號轉導，并導致一系列病理生理學改變。近年來研究表明。Smurf2通過選擇性介導c-Ski、SnoN、Smad7、Smad2和TβRI等蛋白的降解而參與調節(jié)TGF-β1/Smads信號通路，參與肝、腎、皮膚纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展。目前Smurfs在肺纖維化中的作用尚不清楚。
　　目的:探討Smurf2在 TG

5、F-β1誘導人肺成纖維細胞活化中的作用及可能的分子機制
　　方法:（1）體外培養(yǎng)人肺成纖維細胞MRC-5。(2)以人肺成纖維細胞MRC-5為研究對象，隨機分為4組：其中三組分別加入外源性TGF-β1（10μg·L-1）作用1、2和6 h后（分別為TGF-β11 h、TGF-β12 h和TGF-β16 h組），另一組設為對照組（不加TGF-β1）。RT-PCR和Western blotting法分別檢測各組細胞中Smurf1和Smu

6、rf2 mRNA和蛋白的表達水平。（3）采用siRNA干擾技術沉默人肺成纖維細胞中Smurf2的基因表達：體外培養(yǎng)MRC-5細胞，隨機分為對照組（未加入TGF-β1或siRNA）、TGF-β1組（10μg·L-1 TGF-β1）、Control siRNA轉染組（10μg·L-1TGF-β1+Control siRNA）和Smurf2 siRNA轉染組（10μg·L-1 TGF-β1+Smurf2 siRNA）。（4）Western b

7、lotting法檢測各組細胞中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和I型膠原α1（COL1A1）的表達水平；（5）RT-PCR和Western blotting法分別檢測各組細胞中Smad7、核轉錄共抑制因子SnoN、TGF-βI型受體（TβRI）、Smad2和Smad3 mRNA和蛋白的表達水平。
　　結果:（1）與對照組比較，各TGF-β1組細胞中Smurf2 mRNA和蛋白表達水平均明顯升高（P<0.05），且隨著TGF-β1作

8、用時間的延長，其表達水平呈逐漸增加的趨勢；（2）與對照組比較，各TGF-β1組細胞中Smurf1表達水平無明顯變化（P>0.05）。（3）與TGF-β1組比較，Smurf2 siRNA組細胞中Smurf2蛋白表達水平下降（P<0.05）。（4）與對照組比較，TGF-β1組細胞中α-SMA和COL1A1蛋白表達水平均明顯升高（P<0.05）；（5）與TGF-β1組比較，Smurf2 siRNA組細胞中α-SMA和COL1A1蛋白表達水平均

9、下降（P<0.05）。（6）與對照組比較，TGF-β1組和Smurf2 siRNA組細胞中Smad7和SnoN mRNA表達水平均升高（P<0.05），而Smurf2siRNA組與TGF-β1組細胞中Smad7和SnoN mRNA表達水平比較無明顯變化（P>0.05）。（7）與對照組比較，TGF-β1組細胞中Smad7和SnoN蛋白表達水平均有所下降（P<0.05）；（8）與TGF-β1組比較，Smurf2 siRNA組細胞中Smad7

10、和SnoN蛋白表達水平升高（P<0.05）。（9）與對照組比較，TGF-β1組和Smurf2 siRNA組細胞中TβRI mRNA和蛋白表達水平均升高（P<0.05），而Smurf2 siRNA組與TGF-β1組細胞中TβRI mRNA和蛋白表達水平比較無明顯變化（P>0.05）。（10）各組細胞中Smad2和Smad3 mRNA和蛋白表達水平比較無明顯變化（P>0.05）。
　　結論:
　　（1）體外，TGF-β1促進人肺