姜黃素對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者PBMC破骨細(xì)胞生成的影響及可能機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　本研究通過(guò)細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，觀察姜黃素對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)生成破骨細(xì)胞數(shù)量、活力，和轉(zhuǎn)錄因子c-Fos、NFATc1的表達(dá)及MAPKs信號(hào)通路ERK1/2、p38和JNK磷酸化的影響。進(jìn)一步在TNF-旺、RNAKL、M-CSF等細(xì)胞因子不同誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)健康志愿者及RA患

2、者PBMC，并予姜黃素干預(yù)，觀察炎性因子TNF-α對(duì)PBMC破骨細(xì)胞生成的影響，以及姜黃素在炎性條件下對(duì)PBMC破骨細(xì)胞生成及細(xì)胞RANK蛋白及mRNA的影響。探討姜黃素對(duì)RA患者破骨細(xì)胞生成、活化的影響及其可能的機(jī)制，為臨床應(yīng)用姜黃素提供新的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，也為活血化瘀中藥治療RA提供新思路。
　　方法:
　　1、(1)采集RA患者外周血，密度梯度離心法獲得PBMC，貼壁法純化。用含細(xì)胞因子RANKL(100 nmol/L)，

3、 M-CSF(50 nmol/L)和20％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)法培養(yǎng)，隔天換液。分別于14天、21天后通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征、TRAP染色及骨吸收陷窩鑒定所得細(xì)胞。(2) CCK-8檢測(cè)不同濃度姜黃素溶液對(duì)PBMC的毒性，確定實(shí)驗(yàn)用姜黃素溶液的濃度。(3)設(shè)空白對(duì)照組，姜黃素低濃度組（2.5μmol/L），姜黃素中濃度組（5μmol/L）和姜黃素高濃度組(10μmol/L)，每組3復(fù)孔。誘導(dǎo)培養(yǎng)RA患者PBMC，按分組給予姜黃素干

4、預(yù)。14天后行TRAP染色并計(jì)數(shù);檢測(cè)細(xì)胞酸性磷酸酶活性;ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中CatK、MMP-9含量;Western-blot檢測(cè)破骨細(xì)胞c-Fos、NFATc1和ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK、p-JNK蛋白的表達(dá);計(jì)算MAPKs磷酸化率。
　　2、(1)采集健康志愿者及RA患者PBMC誘導(dǎo)培養(yǎng)。根據(jù)PBMC來(lái)源及誘導(dǎo)液組成的不同分為N0(健康，R+M)，N1(健康，2.5 ng/ml TN

5、F-α+M)，N2(健康，5ng/ml TNF-α+M)，N3(健康，10 ng/ml TNF-α+M)，N4(健康，5ng/ml TNF-α+R+M)，R0(RA，R+M)，R1(RA，2.5 ng/ml TNF-α+M), R2(RA,5ng/ml TNF-α+M), R3(RA,10ng/ml TNF-α+M), R4(RA,5ng/ml TNF-α+R+M)共8組，每組3復(fù)孔。14天后行TRAP染色鑒定及細(xì)胞計(jì)數(shù)。(2)設(shè)空白對(duì)

6、照組，TNF-α低濃度組(2.5ng/ml)、TNF-α.中濃度組(5ng/ml)和TNF-α高濃度組(10ng/ml)。分別與RANKL（100 nmol/L）+M-CSF（50 nmol/L）聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)RA患者PBMC。14天后行TRAP染色并計(jì)數(shù);Western-blot法檢測(cè)細(xì)胞RNAK、TRAP6蛋白表達(dá)。(3)設(shè)空白對(duì)照組，姜黃素低濃度組（2.5μmol/L），姜黃素中濃度組（5μmol/L）和姜黃素高濃度組（10μmol

7、/L），用含TNF-α(5ng/ml)、RANKL(100 nmol/L)、M-CSF(50 nmol/L)和20％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)RA患者PBMC，并按分組給予不同濃度姜黃素干預(yù)。14天后行TRAP染色計(jì)數(shù)，RT-PCR法、Western-blot法檢測(cè)細(xì)胞RANK mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.(1)培養(yǎng)14天后，光鏡下細(xì)胞形態(tài)特征、TRAP染色及骨吸收陷窩結(jié)果鑒定本實(shí)驗(yàn)方法誘導(dǎo)RA患

8、者PBMC獲得的細(xì)胞符合破骨細(xì)胞特點(diǎn)。(2) CCK-8結(jié)果顯示姜黃素濃度2.5，5，10μmol/L組在24h，48h，72h的細(xì)胞活力與不含姜黃素組無(wú)明顯差異;姜黃素濃度20、40μmol/組24h，48h，72h細(xì)胞活力均顯著下降(p＜0.05)，因此認(rèn)為20μmol/L以上姜黃素溶液具有細(xì)胞毒性。故將姜黃素干預(yù)濃度分別設(shè)為2.5μmol/L、5μmol/L和10μmol/L。(3)RA患者PBMC加入不同濃度姜黃素溶液培養(yǎng)14天

9、后，姜黃素低濃度組、姜黃素中濃度組和姜黃素高濃度組TRAP染色細(xì)胞計(jì)數(shù)（個(gè)/10個(gè)視野）分別為96.89±3.51、76.44±1.88和62.56±2.70，低于空白對(duì)照組131.00-4.03(p＜0.05);各濃度組的酸性磷酸酶活性(U/L)分別為5.74±0.36、4.21±0.12和3.06±0.07均低于空白對(duì)照組7.48±0.22(p＜0.05)。各組ELISA法檢測(cè)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中CatK、MMP-9含量也均低于空白對(duì)

10、照組(p＜0.05)。(4) Western-blot檢測(cè)結(jié)果，低、中、高濃度姜黃素組c-Fos蛋白分別為0.354±0.077、0.273±0.022和0.176±0.025均低于空白對(duì)照組1.073±0.073(p＜0.05);NFATc1蛋白分別為0.352±0.059、0.387±0.075和0.245±0.020也低于空白對(duì)照組1.133±0.066(p＜0.05)。Western-blot檢測(cè)破骨細(xì)胞ERK1/2、p-ERK

11、1/2、p38、 p-p38、 JNK和p-JNK蛋白，并計(jì)算磷酸化率。結(jié)果顯示，姜黃素低濃度組、姜黃素中濃度組和姜黃素高濃度組ERK1/2的磷酸化率(％)為0.510±0.062、0.400±0.003和0.281±0.020低于空白對(duì)照組0.758±0.016; p-38磷酸化率(％)分別為0.512±0.008、0.464±0.063和0.382±0.032低于空白對(duì)照組0.759±0.054; JNK磷酸化率(％)分別為0.43

12、4±0.010、0.396±0.004和0.316±0.027低于空白對(duì)照組0.734±0.032。且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　2.(1)培養(yǎng)14天后，TRAP染色結(jié)果顯示，N1、N2、N3和R1、R2、R3組的細(xì)胞TRAP染色后胞質(zhì)僅有少許紫紅色淡染，細(xì)胞小，形態(tài)以圓形或橢圓形為主，仍為單核，不具有典型破骨細(xì)胞特征。(2) N0、N4、R0、R4細(xì)胞TRAP染色陽(yáng)性。細(xì)胞計(jì)數(shù)（個(gè)/10個(gè)視野）R0組為117.56

13、±8.96高于N0組100.11±7.46，R4組為124.78±11.72高于N0組114.33±10.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。(3)不同濃度TNF-α和RANKL+M-CSF聯(lián)合誘導(dǎo)RA患者外周血PBMC14天后，TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)、Western-blot檢測(cè)RANK和TRAP6蛋白結(jié)果顯示TNF-α低、中、高濃均高于不加TNF-α的空白對(duì)照組的，且促進(jìn)作用都隨TNF-α濃度升高而升高，各指標(biāo)各組間差異均有統(tǒng)

14、計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。(5)姜黃素干預(yù)TNF-α+RNAKL+M-CSF聯(lián)合誘導(dǎo)的RA患者PBMC14天后，結(jié)果顯示能姜黃素能降低TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及RNAK mRNA和蛋白量，且抑制作用隨濃度增高呈增強(qiáng)趨勢(shì)(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　本研究通過(guò)觀察姜黃素對(duì)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)生成破骨細(xì)胞數(shù)量、活性及相關(guān)信號(hào)通路的影響，得出以下初步結(jié)論:
　　1、姜黃素具有抑制RA患者PBM

15、C破骨細(xì)胞生成數(shù)量和表達(dá)TRAP、組織蛋白酶K、MMP-9的細(xì)胞活性作用，其機(jī)制可能與通過(guò)降低p-ERK1/2、p-p38、 p-JNK蛋白，由此降低其磷酸化率，從而抑制c-Fos和NFATc1表達(dá)有關(guān)。這提示姜黃素可以通過(guò)磷酸化MAPKs通路，在抑制破骨細(xì)胞生成和活化中起重要作用。
　　2、RA患者PBMC破骨細(xì)胞生成能力大于健康人。
　　3、TNF-α在沒(méi)有RANKL的條件下不能誘導(dǎo)PBMC生成破骨細(xì)胞，但是能增加RAN