PaR-4表達(dá)水平與胰腺癌細(xì)胞發(fā)生順鉑耐藥的關(guān)系.pdf

1、目的：
　　胰腺癌(Pancreatic cancer，PC)，是發(fā)生在胰腺的惡性腫瘤。是肝膽外科的常見腫瘤。由于早期的胰腺癌沒有明顯癥狀，通常確診的病人都是晚期患者。大約90％的患者就診時(shí)，已經(jīng)無法進(jìn)行根治性的手術(shù)治療。統(tǒng)籌整個(gè)患者群體，五年生存率低于5％。大部分患者只能選擇化療作為治療手段。傳統(tǒng)的化學(xué)藥物對于胰腺癌的控制幾乎沒有什么作用。過去常用藥物5-氟尿嘧啶(5'-Fluorouracil，5-FU)，對胰腺癌的反應(yīng)率也很

2、少超過25％?，F(xiàn)在，胰腺癌的第一線標(biāo)準(zhǔn)治療仍然是單一使用吉西他濱來化療，其劑量建議1000mg/m2。但吉西他濱的反應(yīng)率并不突出，也不能完全治愈胰腺癌，吉西他濱的影響有限，只能稍微提升生活品質(zhì)，它對正常細(xì)胞毒性較小，能夠減輕疼痛，稍稍延長患者生命。目前，對胰腺癌沒有非常有效的抗癌藥品可供選擇，吉西他濱在1998年被美國食品藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)核準(zhǔn)為用于治療胰腺癌的第一個(gè)化療藥品。

3、2005年11月，美國食品藥物管理局核準(zhǔn)了靶向治療藥物埃羅替尼(Erlotinib，即特羅凱)可聯(lián)合吉西他濱合使用，作為胰腺癌的一線化療手段。聯(lián)合使用在存活期及反應(yīng)率比較上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是臨床治療上并不能發(fā)現(xiàn)其帶來的明顯好處。順鉑(cisplatin，CDDP)是經(jīng)典的化療藥物，因?yàn)橐认侔┖苋菀装l(fā)生順鉑耐藥，故沒有用在胰腺癌化療上。而胰腺癌順鉑耐藥機(jī)制，目前尚不清楚。
　　前列腺凋亡反應(yīng)蛋白-4(Prostate apoptos

4、is response-4，Par-4)，最早被發(fā)現(xiàn)在前列腺癌細(xì)胞中，是一個(gè)促凋亡反應(yīng)蛋白。它是PAR4基因的表達(dá)產(chǎn)物。Par-4蛋白具有獨(dú)特的促腫瘤細(xì)胞凋亡，卻不影響正常細(xì)胞的作用，這使得Par-4蛋白的安全性非常高。再者，Par-4蛋白可以從內(nèi)源性和外源性兩種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，這讓它的抗腫瘤能力成倍上升。Par-4在一系列的人類癌癥組織中都被發(fā)現(xiàn)下調(diào)包括胰腺癌，它的下調(diào)被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵事件之一，而且在胰腺癌的細(xì)胞中，Pa

5、r-4蛋白的低表達(dá)預(yù)示著非常差的預(yù)后。Par-4蛋白僅憑自身就可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡反應(yīng)，而且還可通過增加腫瘤細(xì)胞對凋亡介質(zhì)的敏感性，如阿霉素、TNF-α(tumor necrosis factor-α)，TNF相關(guān)的凋亡反應(yīng)配體，來觸發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡反應(yīng)。研究還顯示，結(jié)腸癌細(xì)胞對5-FU的敏感性可被Par-4增加。特別是在胰腺癌細(xì)胞中，Par-4在調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的小分子阻斷劑導(dǎo)致的胰腺癌細(xì)胞凋亡事件中，扮演著調(diào)節(jié)敏感性的重要角色。

6、近年來，Par-4已經(jīng)被作為一個(gè)非常重要的靶向治療的位點(diǎn)，許多臨床試驗(yàn)也已經(jīng)開展。但是，Par-4的下調(diào)是否與胰腺癌的順鉑耐藥有關(guān)，到底怎樣參與了耐藥過程，還沒有相關(guān)研究。猜測耐順鉑的胰腺癌細(xì)胞中發(fā)生了EMT，Par-4蛋白水平更低。下面來探討CDDP耐藥的胰腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制。
　　方法和結(jié)果：
　　1、以CDDP誘導(dǎo)建立胰腺癌耐藥細(xì)胞株BXPC-3/CDDP。
　　以西南醫(yī)院肝膽實(shí)驗(yàn)室的BXPC-3細(xì)胞為親本細(xì)胞，

7、培養(yǎng)液中CDDP濃度從0.1μg/ml開始，濃度逐漸升至1μg/ml。建成BXPC-3/CDDP耐藥細(xì)胞株。與BXPC-3細(xì)胞相比，BXPC-3/CDDP細(xì)胞更為細(xì)長，細(xì)胞較分散，呈間充質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài)改變。MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞耐藥性。
　　結(jié)果顯示BXPC-3/CDDP細(xì)胞較其親本細(xì)胞BXPC-3明顯耐藥。BXPC-3的耐順鉑細(xì)胞株BXPC-3/CDDP建立成功。
　　以上結(jié)果說明用成功用CDDP濃度梯度法誘導(dǎo)BXPC-3變?yōu)锽

8、XPC-3/CDDP。
　　2、探索耐藥細(xì)胞株BXPC-3/CDDP與EMT的關(guān)聯(lián)。
　　用western blot檢測BXPC-3和BXPC-3/CDDP中EMT標(biāo)志物：snail，twist，E-cadherin，N-cadherin，并作出比較。細(xì)胞Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)評價(jià)其與親本細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　結(jié)果顯示，相比BXPC-3細(xì)胞，BXPC-3/CDDP細(xì)胞中snail表達(dá)水平上升，twist1表達(dá)水平

9、上升，E-cadherin水平下降，N-cadherin水平上升。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示：BXPC-3/CDDP較其親本細(xì)胞BXPC-3侵襲力上升。在BXPC-3/CDDP中，較其親本細(xì)胞BXPC-3，發(fā)生了EMT。
　　以上結(jié)果說明：BXPC-3/CDDP，較其親本細(xì)胞BXPC-3，發(fā)生了EMT改變。
　　3、探索耐藥細(xì)胞株BXPC-3/CDDP中Par-4在mRNA和蛋白水平表達(dá)的情況。
　　Western b

10、lot檢測耐藥細(xì)胞株BXPC-3/CDDP中Par-4蛋白表達(dá)水平，RT-PCR檢測耐藥細(xì)胞株BXPC-3/CDDP中Par-4mRNA水平。以上結(jié)果顯示，較BXPC-3，BXPC-3/CDDP中Par-4在蛋白和mRNA水平均降低了。
　　4、Par-4的過表達(dá)與BXPC-3/CDDP細(xì)胞的順鉑耐藥性、EMT有關(guān)。
　　5、在BXPC-3/CDDP中采用過表達(dá)Par-4策略，用慢病毒包裝轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Par-4后，

11、EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin，N-cadherin用western blot檢測。腫瘤細(xì)胞Transwell侵襲試驗(yàn)用來檢測其轉(zhuǎn)染后與未轉(zhuǎn)染的侵襲力對比。MTT試驗(yàn)檢測耐藥性。
　　結(jié)果顯示，在BXPC-3/CDDP中過表達(dá)Par-4后，E-cadherin水平上升，N-cadherin水平下降。細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移水平下降，耐藥性降低。呈MET改變。
　　以上結(jié)果顯示在BXPC-3/CDDP中從基因?qū)用嫔险{(diào)PAR4，會(huì)使腫

12、瘤細(xì)胞發(fā)生MET改變，耐藥能力下降。
　　6、干擾BXPC-3中PAR-4基因后，細(xì)胞上皮表型發(fā)生改變。
　　在BXPC-3中采用RNA干擾策略，降低Par-4表達(dá)。轉(zhuǎn)染Par-4SiRNA(small interfering RNA，小干擾RNA)后，western blot檢測EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin，N-cadherin。腫瘤細(xì)胞Transwell侵襲試驗(yàn)用來檢測干擾前后侵襲力對比。用MTT試驗(yàn)來檢測干擾前

13、后細(xì)胞耐藥性。
　　結(jié)果顯示，在BXPC-3中敲除Par-4后，E-cadherin水平下降，N-cadherin水平上升。細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移水平上升，耐藥性增高。呈EMT改變。
　　以上結(jié)果證明從基因?qū)用嫦抡{(diào)BXPC-3中PAR-4基因后，腫瘤細(xì)胞發(fā)生了EMT趨勢，耐藥性增加，侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。
　　7、BXPC-3中PAR-4基因下調(diào)后，細(xì)胞發(fā)生的EMT與PI3K/Akt(pho sphatidylinositol3-k

14、inase，磷脂酰肌醇3激酶)信號通路有關(guān)。
　　在BXPC-3中采用RNA干擾策略。轉(zhuǎn)染Par-4SiRNA后，加入PI3K/Akt阻斷劑LY294002來阻斷該信號通路。EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin，N-cadherin用western blot來檢測。腫瘤細(xì)胞Transwell侵襲試驗(yàn)用來檢測加阻斷劑前后侵襲力對比。用MTT試驗(yàn)來檢測加阻斷劑前后腫瘤細(xì)胞耐藥性。
　　結(jié)果顯示，在BXPC-3中敲除Par-4，加

15、入PI3K/Akt阻斷劑LY294002后，E-cadherin水平較未加阻斷劑組上升，N-cadherin水平較未加阻斷劑組下降。細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移水平較未加阻斷劑組下降，耐藥性降低。EMT改變被阻斷。另一試驗(yàn)證實(shí)，BXPC-3轉(zhuǎn)染Par-4siRNA后隨時(shí)間推移測western測pAkt/totalAkt比值，呈逐漸上升趨勢。
　　以上結(jié)果表明基因?qū)用鍼AR4的下調(diào)通過PI3K/Akt途徑激活了EMT，導(dǎo)致了BXPC-3細(xì)胞順鉑耐藥

16、。
　　8、腫瘤細(xì)胞裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)。
　　接種腫瘤細(xì)胞后，用順鉑腹腔注射治療，測各組腫瘤體積變化與70天生存率。
　　結(jié)果顯示，順鉑對Par-4siRNA-transfected BXPC-3組幾乎沒有作用，但加入PI3K/Akt阻滯劑LY294002后，該組的順鉑耐藥被逆轉(zhuǎn)。
　　以上解說表明，在體外實(shí)驗(yàn)中，阻斷PI3K/Akt途徑可以逆轉(zhuǎn)Par-4下調(diào)引起的EMT介導(dǎo)的耐藥。
　　結(jié)論：
　　本研