巨噬細胞極化微環(huán)境促肺癌發(fā)生與藥物治療.pdf

1、腫瘤的惡性進展與巨噬細胞極化微環(huán)境密切相關。在腫瘤的形成中，極化的M2型巨噬細胞創(chuàng)造了一種炎性環(huán)境促進腫瘤生長。然而，巨噬細胞極化微環(huán)境與腫瘤進展是否有直接關系，至今尚無定論。因此，明確巨噬細胞極化微環(huán)境促進腫瘤發(fā)展的機制對腫瘤治療甚為關鍵。本課題以肺癌為研究對象，目的是研究巨噬細胞極化微環(huán)境對肺癌的促進及藥物治療，以期為肺癌防治提供有效措施。
　　本研究首先考察體外巨噬細胞極化微環(huán)境對LLC細胞是否有直接影響，采用小鼠腹腔巨噬細

2、胞（PEMs），用LPS（10 ng/ml）將PEMs極化為M1型巨噬細胞；用IL-4（10 ng/ml）誘導PEMs為M2型巨噬細胞；通過熒光雙染法檢測極化的巨噬細胞與LLC細胞共培養(yǎng)；MTT法和PCNA免疫熒光法檢測巨噬細胞條件培養(yǎng)基對LLC細胞增殖影響；細胞劃痕實驗、Transwell實驗分析巨噬細胞條件培養(yǎng)基對LLC細胞遷移、侵襲的關系。此外，本課題還研究了體外巨噬細胞極化微環(huán)境對新生血管生成的影響，MTT法和PCNA免疫熒光法

3、檢測巨噬細胞條件培養(yǎng)基對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）的促增殖作用；伊文斯蘭滲出法檢測HUVEC細胞體外通透性；雞胚尿囊膜（CAM）模型研究巨噬細胞條件培養(yǎng)基對新生血管形成的影響。接著，為探索巨噬細胞極化微環(huán)境促癌機制，我們用AO/EB熒光雙染法檢測細胞凋亡；免疫熒光法檢測自噬相關蛋白LC3-B、P62表達；DQ-Green BSA降解實驗觀察細胞溶酶體活性；DAF-2 DA和DCF-DA分別檢測細胞內(nèi)NO和ROS。最后，我們建立烏拉坦

4、誘導的小鼠肺癌模型，流式細胞術和Western Blot檢測肺癌小鼠肺泡細胞中巨噬細胞表型；ELISA試劑盒檢測肺癌小鼠血清中5-HIAA和肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-12、TNF-α、TGF-β、IL-10、IL-4含量；免疫組化法檢測小鼠肺組織中LC3-B、P62和CD31蛋白的表達；伊文斯蘭滲出法檢測肺血管通透性。另外，為充分證明巨噬細胞極化微環(huán)境促進肺癌發(fā)生的機制，我們使用巨噬細胞耗竭劑、自噬抑制劑和血管保護劑治療肺癌小鼠，觀

5、察其對肺癌發(fā)生的阻止作用。
　　本研究表明，M1型巨噬細胞對LLC細胞吞噬能力明顯比極化前強，而M2型巨噬細胞對LLC細胞吞噬能力明顯比極化前弱。極化的M1型和M2型巨噬細胞條件培養(yǎng)基對LLC細胞增殖、遷移、侵襲無明顯影響，然而，我們意外的發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細胞條件化培養(yǎng)基能促進體外HUVEC的增殖、增加HUVEC細胞體外通透性、誘導雞胚尿囊膜（CAM）新生血管形成，而M1型巨噬細胞條件化培養(yǎng)基對此沒有影響。機制研究顯示，1％血清饑餓

6、條件下，M2型巨噬細胞條件培養(yǎng)基明顯增加HUVEC細胞自噬小體及LC3-B蛋白表達，但減少自噬底物P62蛋白和DQ-Green BSA的降解，而自噬抑制劑氯喹在不影響HUVEC細胞增殖濃度下降低HUVEC通透性。此外，我們也發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細胞條件化培養(yǎng)基可以增加HUVEC細胞內(nèi)NO和ROS水平，使用氯喹抑制自噬后可降低細胞內(nèi)NO和ROS水平。最后，我們在體內(nèi)實驗中觀察到烏拉坦誘導的小鼠肺癌增加肺泡M2型巨噬細胞比例，促進肺組織LC3-