膀胱癌患者尿液中外泌體及相關(guān)miRNAs的檢測及臨床意義.pdf

1、目的：
　　探討差速超速離心法從膀胱癌患者尿液中提取外泌體（ exosome)及相關(guān)微小RNAs(microRNAs,miRNAs)的可行性。對exosome及miRNAs進(jìn)行鑒定,分析其潛在的臨床價(jià)值，為進(jìn)一步在尿液中尋找膀胱癌診斷標(biāo)記物做前期準(zhǔn)備。
　　方法：
　　一、Exosome的差速超速離心提取
　　1.1尿液標(biāo)本的獲取。檢索病例資料數(shù)據(jù)庫，統(tǒng)計(jì)分析既往我院膀胱癌入院患者的數(shù)量及分布情況，說明該實(shí)驗(yàn)標(biāo)本

2、易得。選擇可行的留取膀胱癌患者合格尿液標(biāo)本的方案，制定留取策略，留取標(biāo)本。
　　1.2差速超速離心。劃分非肉眼血尿和肉眼血尿兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組。在留取的100 ml尿液中加入保護(hù)劑。4℃下進(jìn)行離心操作。提前預(yù)冷離心機(jī)和轉(zhuǎn)子。2000 g離心10分鐘后去除大的細(xì)胞碎片；再17000 g離心45分鐘，去除較小的碎片和較大的細(xì)胞外囊泡；然后200000 g離心70分鐘，去除上清液；加入PBS重懸再次離心；最后用40μl去離子水溶解，-80℃凍存

3、，或繼續(xù)下一步實(shí)驗(yàn)。
　　二、Exosome的鑒定分析
　　2.1透射電子顯微鏡觀察。取上步中離心提取的樣品10μl，加入去離子水稀釋后在超聲振蕩儀下將exosome分散開，取10μl稀釋分散后的樣品滴加在超薄碳膜銅網(wǎng)的碳膜面，1分鐘后濾紙從銅網(wǎng)一側(cè)吸去多余的樣品，再滴加5μl多聚甲醛固定液，10分鐘后吸去多余液體；然后滴加5μl PBS溶液，5分鐘，重復(fù)三遍；再滴加5μl戊二醛固定液,10分鐘后吸去多余液體；PBS溶液清洗

4、三遍；最后滴加5μl磷鎢酸染液。1分鐘后，白熾燈下烤干后鏡下觀察。
　　2.2納米微粒追蹤分析(NTA)。開機(jī)，設(shè)置參數(shù)；取3μl離心提取物，加入約0.3 ml水中混勻；將混勻的液體注入，開始分析。
　　2.3免疫印跡實(shí)驗(yàn)。BCA法測定提取的exosome中蛋白濃度。配制所需試劑。將標(biāo)本在95℃下加熱5分鐘變性。然后上樣后進(jìn)行120 V恒壓下電泳。然后350 mA恒流下電轉(zhuǎn)70分鐘。將PVDF膜在5％封閉液中4℃搖晃過夜封閉

5、。然后一抗室溫孵育2小時(shí)，二抗室溫孵育1小時(shí)。顯影觀察目的蛋白的表達(dá)情況。
　　三、miRNA的鑒定分析
　　3.1 miRNA的提取。應(yīng)用miRNA提取試劑盒提取exosome中的miRNA，并測量其濃度。冷凍真空干燥法純化miRNA。
　　3.2 qPCR分析。設(shè)置qPCR參數(shù)：解鏈溫度94℃，時(shí)間2分鐘；變性溫度為94℃，時(shí)間20秒；退火溫度設(shè)置為62℃，時(shí)間34秒。循環(huán)43次。
　　結(jié)果：
　　1、

6、本院膀胱癌入院患者數(shù)量較多，簽訂知情同意書可提高留取合格尿液標(biāo)本的成功率，為23/25。
　　2、差速超速離心法可穩(wěn)定的從膀胱癌患者尿液中提取外泌體。
　　3、電鏡、NTA和免疫印跡結(jié)果顯示離心提取物中大量外泌體的存在，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其中混雜有胞外囊泡。
　　4、通過qPCR檢測到健康人尿液和膀胱癌患者尿液中15b-5p等miRNA具有顯著性的差異。
　　結(jié)論：
　　1、本研究獲取大量尿液標(biāo)本的可行性高。