腫瘤FOXP3促胰腺導管腺癌招募Treg及機制研究.pdf

1、背景：
　　FOXP3是主要表達于CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的標志性轉(zhuǎn)錄因子[1]。它的主要功能是促進T細胞向調(diào)節(jié)性T細胞的分化，促進機體的免疫抑制功能[2]。然而，近期多項研究顯示，除外T細胞，F(xiàn)OXP3也被發(fā)現(xiàn)表達于多種腫瘤細胞，如乳腺癌細胞、腎癌細胞與黑色素瘤細胞等等[3-5]。研究腫瘤源性 FOXP3（cancer-FOXP3, c-FOXP3）的功能，可能為胰腺導管腺癌的靶向治療提供新的靶點。我們在前期實驗與文獻閱讀

2、中發(fā)現(xiàn)，相較于正常組織和細胞系，胰腺導管腺癌組織及細胞系高表達c-FOXP3[6]。因此，我們設(shè)計了該課題以進一步明確c-FOXP3在胰腺導管腺癌組織及細胞中的表達水平、功能效應、以及背后的調(diào)控機制；旨從臨床患者水平、細胞功能水平、分子生物學水平及動物實驗水平深入探索胰腺導管腺癌中c-FOXP3的功能與意義。
　　方法：
　　1.應用胰腺導管腺癌組織的石蠟標本切片進行FOXP3的免疫組化染色,分析c-FOXP3蛋白在胰腺導管

3、腺癌組織中的表達水平；同時收集整理患者的臨床病例資料并行預后隨訪，分析胰腺導管腺癌中c-FOXP3的表達水平與各項臨床病理指標之間的關(guān)系。
　　2.分析胰腺導管腺癌組織標本中c-FOXP3表達水平與Treg細胞在腫瘤局部富集程度的相關(guān)性；并分析c-FOXP3表達于Treg細胞聚集對胰腺導管腺癌患者臨床病理指標及預后的共同影響。
　　3.應用Western blot實驗技術(shù)檢測4個胰腺癌細胞系及正常胰腺導管細胞系的c-FOXP

4、3的表達水平，并構(gòu)建c-FOXP3過表達與降表達穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系；用Western blot驗證構(gòu)建的穩(wěn)系所表達c-FOXP3的水平。通過細胞凋亡、細胞周期、Edu增殖摻入實驗與免疫缺陷動物模型等多種方法檢測 c-FOXP3對腫瘤細胞的直接作用；通過免疫正常的動物模型檢測c-FOXP3對腫瘤免疫微環(huán)境的作用。
　　4.分離人源外周血單個核細胞(Peripheral Mononuclear Cells, PBMCs)與調(diào)節(jié)性T細胞(R

5、egulatory T Cells, Treg cells)。利用共培養(yǎng)系統(tǒng)檢測c-FOXP3對Treg細胞的促增殖作用；利用Transwell系統(tǒng)在體外模擬Treg細胞向腫瘤微環(huán)境的募集過程，檢測Treg細胞的趨化水平。構(gòu)建裸鼠胰腺癌原位成瘤模型，同時由鼠尾靜脈注射人外周血單個核細胞(PBMCs)，體內(nèi)驗證c-FOXP3促Treg細胞向胰腺癌微環(huán)境的趨化作用，
　　5.應用RT-PCR的方法篩選c-FOXP3促進腫瘤細胞所分泌的

6、趨化因子譜；應用Western blot、ELISA及免疫組化染色等實驗驗證RT-PCR結(jié)果；應用CHIP及雙熒光素酶實驗檢測c-FOXP3調(diào)控趨化因子表達分泌的分子機制。
　　6.通過趨化因子阻斷試驗確定c-FOXP3促進Treg細胞向腫瘤微環(huán)境趨化過程的中介因子。構(gòu)建C57/BL黑鼠皮下成瘤動物模型，通過阻斷趨化因子進一步確定c-FOXP3引起Treg細胞向腫瘤微環(huán)境募集的通路及該通路的生物學功能，確定胰腺導管腺癌靶向治療目標

7、，從而實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化。
　　結(jié)果：
　　1. c-FOXP3表達及Treg細胞聚集在胰腺導管腺癌組織中的意義。通過對120例胰腺導管腺癌組織標本進行免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)，c-FOXP3在胰腺導管腺癌中多數(shù)表達陽性，而對應的癌旁正常胰腺組織不表達或表達程度極弱；分析該120例患者的病例資料，我們發(fā)現(xiàn) c-FOXP3高表達的占63.3％（76例）， c-FOXP3低表達的占36.6%（44例）；進一步研究 c-FOXP3蛋白表達水

8、平與臨床病理指標之間的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)高表達c-FOXP3的胰腺導管腺癌患者的總生存期（中位數(shù)：24 vs15個月）與無復發(fā)生存期（中位數(shù)：15 vs9個月）均明顯低于短于c-FOXP3低表達組的患者（p<0.05*）。
　　同時，F(xiàn)OXP3陽性的Treg細胞在胰腺癌組織中也有不同程度的表達。我們深入研究了胰腺導管腺癌腫瘤細胞中c-FOXP3的表達與FOXP3陽性Treg細胞在腫瘤局部微環(huán)境中聚集程度的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩者呈明顯的正相關(guān)

9、(r=0.537， p<0.001**)。統(tǒng)計分析后我們發(fā)現(xiàn)，c-FOXP3高表達同時伴隨 Treg細胞在腫瘤中高度聚集的患者的總生存期及無復發(fā)生存期明顯短于c-FOXP3高表達Treg低浸潤的患者，同時，c-FOXP3高表達同時Treg細胞高度浸潤的患者的腫瘤大小也明顯大于c-FOXP3高表達Treg低浸潤的患者；這些結(jié)果提示，Treg細胞浸潤程度在c-FOXP3高表達對患者生存期的影響中發(fā)揮了重要的生物學功能，引起胰腺導管腺癌的進展

10、。
　　2. c-FOXP3對胰腺導管腺癌細胞系的直接與間接影響。利用 Western blot驗證了c-FOXP3在4個胰腺癌細胞系（PANC-1、MIA PaCa-2、AsPC-1及BxPC-3）均有不同程度的表達，而在正常胰腺細胞系HPDE6C7中表達極弱；并且成功構(gòu)建了2個過表達 c-FOXP3的胰腺癌細胞系(PANC-1及 AsPC-1)和2個降表達c-FOXP3的細胞系(MIA PaCa-2和BxPC-3)，構(gòu)建的穩(wěn)系

11、經(jīng)Western blot驗證了c-FOXP3表達的變化。通過細胞凋亡、細胞周期、Edu增殖摻入與免疫缺陷動物模型證明c-FOXP3對腫瘤細胞無明顯的直接影響。
　　3.免疫系統(tǒng)完整的小鼠體內(nèi)皮下成瘤實驗證實，降表達c-FOXP3的胰腺癌細胞成瘤大小明顯小于其對照組細胞成瘤，并且其瘤塊中Treg浸潤也明顯少于對照組；同時，CD25抗體特異清除免疫系統(tǒng)完整小鼠 Treg細胞后，降表達c-FOXP3的胰腺癌細胞成瘤與對照組成瘤大小無統(tǒng)

12、計學差別，證明了Treg細胞參與c-FOXP3對腫瘤細胞生物學功能的間接影響。
　　4.利用體外共培養(yǎng)腫瘤細胞與Treg細胞實驗，通過Edu增殖摻入檢測發(fā)現(xiàn)c-FOXP3不能促進Treg細胞自身增殖。利用體外Transwell趨化實驗，通過流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，胰腺導管腺癌細胞過表達c-FOXP3后對Treg細胞的趨化能力增強；而降表達c-FOXP3后對Treg的趨化能力下降。裸鼠原位成瘤實驗證實，過表達c-FOXP3的人源胰腺癌細

13、胞成瘤對經(jīng)由鼠尾注射的人外周血單個核細胞中Treg細胞的趨化能力明顯強于未過表達c-FOXP3的對照組成瘤。
　　5.實時定量PCR篩選出趨化因子CCL5表達水平隨c-FOXP3表達變化而變化的程度最為顯著，Western blot證實，胰腺癌細胞內(nèi)CCL5表達水平受c-FOXP3的調(diào)控；ELISA實驗證實，胰腺癌細胞向外釋放CCL5的水平也受c-FOXP3調(diào)控；同時免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，c-FOXP3與 CCL5的表達胰腺癌組織中呈

14、現(xiàn)共定位，并有明顯的正相關(guān)性(r=0.681, P<0.001**)。
　　5.利用Panc-1、Pan02和293T細胞系，我們行ChIP實驗發(fā)現(xiàn)人源與鼠源轉(zhuǎn)錄因子FOXP3均可分別直接結(jié)合于相應種屬CCL5的啟動子區(qū)；同時雙熒光素酶實驗證實，過表達 c-FOXP3后 CCL5啟動子轉(zhuǎn)錄活性增強，而突變上述FOXP3與CCL5結(jié)合位點后，其轉(zhuǎn)錄活性的增強即被反轉(zhuǎn)，從而證實c-FOXP3可以直接調(diào)控CCL5的表達。
　　6.

15、體外Transwell趨化模型阻斷實驗發(fā)現(xiàn)，通過對CCL5進行中和阻斷可明顯減弱過表達c-FOXP3的胰腺癌細胞對Treg細胞的趨化作用；體內(nèi)胰腺皮下成瘤實驗發(fā)現(xiàn)，CCL5阻斷不僅減弱了 Treg細胞向腫瘤局部的浸潤，同時抑制了腫瘤的生長，并且該現(xiàn)象在高表達c-FOXP3的腫瘤中更為明顯。
　　結(jié)論：
　　1. c-FOXP3蛋白在胰腺導管腺癌組織及細胞系中呈現(xiàn)陽性表達；c-FOXP3表達水平與Treg細胞聚集程度正相關(guān)；c

16、-FOXP3表達水平較高且Treg細胞比例高的患者預后較差。
　　2. c-FOXP3直接結(jié)合至CCL5的啟動子區(qū)，并促進其轉(zhuǎn)錄翻譯過程，上調(diào)CCL5在胞內(nèi)的表達及其向胞外的分泌。
　　3.以CCL5為介導，c-FOXP3促進了胰腺導管腺癌細胞對Treg細胞的趨化能力。高表達的c-FOXP3與Treg細胞在腫瘤微環(huán)境中的高度浸潤共同作用，促進胰腺導管腺癌腫瘤的生長。
　　4.對高表達c-FOXP3的胰腺導管腺癌腫瘤進行