基于代謝調(diào)控提高產(chǎn)氣腸桿菌產(chǎn)氫效率及其可再生底物預(yù)處理方法研究.pdf

1、氫能被認為是未來最理想的能源之一。生物制氫因具有可持續(xù)、條件溫和、環(huán)境友好，且可與污染物處理相偶聯(lián)等優(yōu)點，而越來越受到人們的重視。然而，截至目前生物制氫的研究尚未取得突破性進展，工程菌的產(chǎn)氫效率遠未達到產(chǎn)業(yè)化的要求。因此，闡明生物產(chǎn)氫機理、提高產(chǎn)氫效率仍是生物制氫亟待解決的重要科學(xué)問題。
　　本研究以一株野生型產(chǎn)氣腸桿菌(Enterbacter aerogenes) CCTCC AB91102為出發(fā)菌株，該菌為兼性厭氧菌，且分子生

2、物學(xué)操作便利，生長速率高，在理想條件下具有最高的理論產(chǎn)氫效率(10mol H2/mol葡萄糖)，產(chǎn)氫能力提升空間大。為提高 E. aerogenes的產(chǎn)氫能力，并明晰其產(chǎn)氫機理，分別或同時敲除了吸氫酶基因和產(chǎn)氫競爭途徑中關(guān)鍵酶基因，在此基礎(chǔ)上，通過過表達 NAD合成酶，研究了細胞中 NAD水平對產(chǎn)氫代謝中碳流分配的影響。同時，為使得到的高效產(chǎn)氫工程菌能夠運用到實際生產(chǎn)中，還對可再生廢棄物的預(yù)處理方法進行了探索，以微藻水解產(chǎn)物為底物，高效

3、工程菌為生產(chǎn)菌株，進行了厭氧批次產(chǎn)氫發(fā)酵實驗，優(yōu)化了發(fā)酵參數(shù)。主要研究內(nèi)容和結(jié)果摘要如下。
　　1.敲除競爭途徑關(guān)鍵酶基因ldh和ppc對產(chǎn)氣腸桿菌產(chǎn)氫的影響。乳酸和琥珀酸是E. aerogenes CCTCC AB91102除產(chǎn)氫外最主要的糖酵解產(chǎn)物。本研究從該菌基因組DNA中克隆得到編碼產(chǎn)乳酸途徑關(guān)鍵酶乳酸脫氫酶(LDH)的基因ldh和產(chǎn)琥珀酸途徑關(guān)鍵酶編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的基因 ppc。利用這兩個基因的PC

4、R產(chǎn)物在Red重組系統(tǒng)的介導(dǎo)下與基因組中的基因進行同源重組。經(jīng)PCR驗證、抗性驗證和代謝產(chǎn)物分析，表明目標基因已從基因組中完全敲除。所得到的三個突變菌株中 AB91102-L(Δldh)和 AB91102-P(Δppc)產(chǎn)氫效率相對野生菌分別提高了12.4％和32.2%，產(chǎn)氫量分別降低4.5%和6.1%，AB91102-L產(chǎn)乳酸途徑被阻斷，AB91102-P產(chǎn)琥珀酸降低94.6%。雙基因敲除菌株AB91102-LP(Δldh，Δppc)

5、生長緩慢，產(chǎn)氫量顯著降低。
　　2.敲除吸氫途徑關(guān)鍵酶小亞基基因 hybO對產(chǎn)氣腸桿菌產(chǎn)氫的影響。從 E. aerogenes基因組中克隆得到hybO基因后，其PCR產(chǎn)物通過Red重組系統(tǒng)介導(dǎo)與野生菌、AB91102-L和 AB91102-P分別進行同源重組得到三個突變菌株 AB91102-O(ΔhybO)、AB91102-OL(ΔhybO/Δldh)和AB91102-OP(ΔhybO/Δppc)，其中突變菌株AB91102-O和

6、AB91102-OP的產(chǎn)氫效率相對野生菌分別提高24.0%和68.8%，產(chǎn)氫量相對野生菌分別增加21.3%和27.6%。AB91102-OP產(chǎn)氫能力的顯著增長表明，減少氫氣消耗和阻斷競爭代謝途徑是提高產(chǎn)氫的有效策略，同時存在某種程度的協(xié)同效應(yīng)。
　　3.過表達NAD合成酶促進產(chǎn)氣腸桿菌及其突變菌產(chǎn)氫的研究。從AB91102基因組中克隆得到編碼NAD合成酶的基因nadE。通過對pET-28(+)質(zhì)粒進行改造，獲得能夠在E. aero

7、genes中表達外源蛋白的質(zhì)粒pET28kan。構(gòu)建pET28kan-nadE，轉(zhuǎn)入AB91102野性型和多株突變體中，SDS-PAGE和Western-Blot實驗證明NAD合成酶內(nèi)源表達成功，獲得兩個突變菌株 AB91102-O/N(ΔhybO/nadE)、AB91102-OP/N(ΔhybO/Δppc/nadE)和一個對照菌株AB91102-OC。厭氧恒化實驗結(jié)果表明，AB91102-ON和AB91102-OP/N的NADH/NA

8、D+總濃度較對照菌分別增加了91.2%和109.7%，但NADH/NAD+比值則分別從1.11下降到0.83和0.94。AB91102-ON的產(chǎn)氫效率和產(chǎn)氫量分別增長了66.0%和165.8%，AB91102-OP/N則分別增長了149.5%和301.1%，AB91102-OP/N的最高產(chǎn)氫量達到了5.1L/L。通過分析代謝終產(chǎn)物濃度、產(chǎn)氫直接相關(guān)的NADH利用率(NADH)UH/Glu(該概念為本文首次提出)以及ADH、LDH和BDD

9、H等酶活的變化，結(jié)果表明：降低氫氣消耗、提高NADH的利用率和提高NAD的總濃度三種策略對促進產(chǎn)氫的協(xié)同效應(yīng)明顯。
　　4.預(yù)處理“微藻提脂殘留物”(LMBRs)的方法研究。利用“脂肪酶發(fā)酵酵母殘余物”(LYBRs)自溶產(chǎn)物中存在的蛋白酶，在48 ℃下催化處理LMBRs24 h，使LMBRs中總氮含量降低了45.0%。將處理和未處理過的樣品進行熱堿法水解，得出在100 ℃下處理過的LMBRs產(chǎn)還原糖和可溶性總氮的量均最高，分別為1

10、89.3 mg/g LBMRs和36.56 mg/g LBMRs，其中氨基酸含量為102.8 mg/g LBMRs；未用自溶產(chǎn)物處理過的LMBRs水解產(chǎn)生的還原糖僅為該產(chǎn)量的87.1%。說明以酵母自溶物預(yù)處理再進行熱堿水解是一種簡單有效的LMBRs處理方法。
　　5.優(yōu)化以 LMBRs水解產(chǎn)物為底物產(chǎn)氫發(fā)酵條件。采用中心組合設(shè)計，通過三次平行實驗取得的數(shù)值，擬合得到反應(yīng)溫度、接種量和pH值與產(chǎn)氫量之間關(guān)系的多元二次回歸模型。方差分